Οι τσαπεροκίνες (πρωτεΐνες θερμικού σοκ - heat shock proteins) στα βαριά άρρωστα παιδιά

Abstract

BACKGROUND: Sepsis remains a critical problem that intensively employs the medical world due to high mortality. Although the rate has decreased over the last decade, thanks due to early detection, intervention and supportive care, the mortality rate of severe sepsis /septic shock remains high. The pathophysiology of sepsis remains a puzzle that’s still has missing pieces. Sepsis is an inflammatory process during which various mediators such as cytokines play an important role among microorganisms and the immune system of the host. It’s known that stimulation of cells by pathogens has as result the initiation of the cascade of pro-inflammatory and anti-inflammatory mediators such as cytokines, lipid markers and reactive oxygen species that together cause vasodilatation and increased permeability resulting in capillary leak, output of plasma and activation of leukocytes into tissues and organs.Additionally, activated mediators stimulate the coagulation system causing disseminated intravascular coagulation. This sequence of tissue events results in hypoperfusion and hypoxia, which is the cause of the organic dysfunction, and which frequently represents the lethal phase of sepsis. An overwhelming immune response in infectious (S,SS) or non-infectious systemic inflammatory response syndrome (SIRS), as mediated by the uncontrolled release of pro-inflammatory mediators, can lead to shock, multiple organ system failure (MOSF), and even death. Identification of the high-risk patients and early treatment of severe sepsis remain a research challenge. Different biomarkers have been studied and proposed as indicators of severity and mortality in sepsis (bacterial agents, acute phase proteins (protein C, procalcitonin, LBP-LPS-binding protein), factors of coagulation (fibrin degrading products, antithrombin III, dimer D) cell membrane markers (HLA-DR, CD64, E-selectin), hormones (cortisol, ACTH) soluble receptors (sCD14, sTNFRI, sTRFRII) and cytokines (TNF, IL-6, IL-8, IL-10). Recent studies have concentrated on heat shock proteins as indicators of the severity of sepsis based on the fact that the HSPs induce the production of interleukins and stimulate immune cells during systemic inflammatory response. Contrasting to animal studies showing an HSP72 protective effect in experimental sepsis, human in vivo or in vitro studies are not conclusive, showing a possible relation to either protection or mortality and morbidity. Although increased circulation of stress proteins signals danger to inflammatory cells and aid in immune surveillance, they have also been liked to deleterious role in some diseases. Thus, increased extracellular HSP72 levels were detected in the plasma of children admitted to the PICU with septic shock and correlated with worse outcome.Another major molecular chaperone, 90-kDa family of HSP (inducible HSP90α), has been shown to interact mainly with about 200 client proteins involved in transcription regulation and signaling-transduction pathways of glucocorticoid receptors, ribonucleoproteins, chromatin remodeling factors, transcription factors, and protein kinases. The guarding role of this abundant “chaperone” is to launch a rapid response to various insults such as heat, hypoxia, reactive oxygen species and injury-released growth factors. Following the contrasting HSP72 human studies, it has been recently shown that activation of the HSP90/Akt pathway induces caspase-3 activation provoking apoptosis in septic mice. Robust correlations, however, between extracellular HSP90α levels with clinically relevant outcome variables during the acute phase of SS or SIRS or with pro- or anti-inflammatory interleukins (IL), nCD64 or metabolic derangements are missing. Similarly, no studies in children have been conducted comparing HSP72, an HSP90α-machinery complement, among different PICU sub cohorts, including SIRS, or relating their levels to the acute phase nCD64 expression or early metabolic patterns, various interleukins, and MOSF. OBJECTIVE: Extracellular heat-shock-proteins (HSP) act as inducers of interleukins (IL) and stimulants for immune cells during systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Little is known about the alarming roles of extracellular HSP72 and HSP90α in acute phase of sepsis (S) or severe sepsis (SS).We hypothesized that increased HSP90α levels could be detected in the serum of critically ill children, especially those with severe sepsis and/or septic shock and in SIRS compared to healthy controls (H), and that extracellular HSP90α might better than the HSP72, also increased in SS, SIRS and MOSF, correlate with MOSF, early acute inflammatory and metabolic stress, severity of illness scores and outcome end-points.METHODS: Critically ill children with S (n=20), SS (n=22) or SIRS (n=23) and H (n=25) were enrolled in the study. Immediately after PICU admission, Blood and urine cultures, pharyngeal and deep tissue swabs, and bronchoalveolar lavage (BAL) were examined and blood samples were taken for study of indicators of inflammation. We determined serum HSP90α, HSP72, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α and neutrophil CD64 (nCD64) expression in children with S or SS compared to SIRS (trauma) or healthy children (H).ELISA was used to evaluate HSPs, chemiluminescence to measure IL, and flow-cytometry to evaluate nCD64 expression. The severity of the illness in studied children was assessed with PRISM (Pediatric Risk of Mortality Score), TISS (Therapeutic Intervention Scoring System) modified for children and PELOAD score (Pediatric Logistic Organ Dysfunction Score) and MOSF. Length of stay (LOS), days on mechanical ventilation (DOMV) and PICU-mortality were the outcome endpoints recorded. Sepsis, severe sepsis, septic shock, and SIRS due to trauma were defined according to the International Pediatric Sepsis Consensus Conference definitions. The MOSF syndrome was defined using the criteria by Wilkinson.RESULTS: Patients in both septic groups had elevated HSP90α, HSP72, IL-6, IL-8 and IL-10 levels compared to H, where as SS had increased HSP72, IL6 and TNF-α compared to SIRS (TBI).SIRS patients presented increased HSP90α, IL-6 and IL-8 compared to H. HSP72 related negatively to metabolic indices and positively to TNF-α and nCD64 only the relation to HDL reached a statistical significance (p<0.001). HSP90 related positively (p<0.001) to nCD64, IL-8, IL-10, CRP, PRISM, PELOD, TISS, and LOS and negatively to HDL (p<0.001) and LDL (p<0.02).HSP90α has a positive relation to various interleukins and acute phase proteins. Both HSPs were dramatically increased among non-survivors. HSP90α, along with HSP72, were dramatically increased among MOSF patients. The HSP90α and HSP72 increases in the MOSF group paralleled: a) significant increases of the inflammatory biomarkers nCD64, IL-6, CRP, and PCT; b) significant decreases of nutritional indices cholesterol, HDL, and LDL, but not glucose. CONCLUSION: Extracellular HSHP72 and HSP90α are alarmingly elevated in critically ill children, especially in severe sepsis. For the first time we report that extracellular HSP90α is significantly elevated in critically ill children with SIRS, especially in pediatric patients with SS. More importantly, we showed the extracellular “chaperokine” HSP90α is associated with MOSF, inflammatory stress, severity of illness, organ dysfunction, length of stay, days on ventilator and predicted mortality. The HSP90α and HSP72 inverse relations to the low-LDL/low-HDL early septic metabolic derangement might well imply a coordinator role for their increased extracellular expressions at the onset of the host response in severe sepsis. Since both HSP are inversely related to the low-LDL / low-HDL septic metabolic pattern, extracellular HSP72 and HSP90α may also play a coordinator role in the host response during severe sepsis. Future studies will be required to further advance our understanding of mechanisms that regulate the immune response during severe sepsis and SIRS related MOSF that may lead to the identification of new diagnostic, prognostic or treatment targets.

Γενικά: Η σήψη παραμένει ένα θέμα που απασχολεί εντατικά τον ιατρικό κόσμο λόγω της υψηλής της θνητότητας. Παρόλο που η θνητότητα έχει μειωθεί την τελευταία δεκαετία χάρη στην έγκαιρη διάγνωση, παρέμβαση, και υποστηρικτική φροντίδα, το ποσοστό της θνητότητας λόγω σοβαρής σήψης/σηπτικής καταπληξίας παραμένει υψηλό. Η παθοφυσιολογία της σήψης παραμένει ένα πάζλ που του λείπουν ακόμα κομμάτια. Η σήψη είναι μια φλεγμονώδης διαδικασία κατά τη διάρκεια της οποίας διάφοροι μεσολαβητές αλληλεπιδρούν, διαδραματίζοντας ένα σημαντικό ρόλο μεταξύ των μικροοργανισμών και του ανοσολογικού συστήματος του ξενιστή. Είναι γνωστό ότι η διέγερση των κυττάρων από παθογόνα έχει σαν αποτέλεσμα την έναρξη ενός καταρράκτη προφλεγμονωδών και αντιφλεγμονωδών μεσολαβητών όπως είναι οι κυτταροκίνες, λιπιδιακοί βιοδείκτες και δραστικές μορφές οξυγόνου. Οι μεσολαβητές αυτοί σε συνδυασμό προκαλούν αγγειοδιαστολή και αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων, με αποτέλεσμα τριχοειδική διαφυγή, διαφυγή πλάσματος στον εξωκυττάριο χώρο, και ενεργοποίηση μορίων προσκόλλησης και λευκοκυττάρων σε ιστούς και όργανα. Επί πλέον, οι ενεργοποιημένοι μεσολαβητές διεγείρουν το σύστημα της πήξης, προκαλώντας διάχυτη ενδαγγειακή πήξη. Αυτή η αλληλουχία των γεγονότων έχει σαν αποτέλεσμα την υποαιμάτωση και ιστική υποξία που είναι αιτία της οργανικής δυσλειτουργίας και συχνά αντιπροσωπεύει το θανατηφόρο στάδιο της σήψης. - Η υπερβολική ανοσολογική απάντηση στις λοιμώξεις (S, SS) ή στο μη-λοιμώδες Σύνδρομο Συστηματικής Φλεγμονώδους Απάντησης (SIRS), καθώς προκαλείται από την ανεξέλεγκτη απελευθέρωση των προφλεγμονωδών μεσολαβητών, μπορεί να οδηγήσει σε καταπληξία, πολλαπλή ανεπάρκεια οργάνων (MOSF), μη αναστρέψιμο σοκ και θάνατο. Παρά τις σημαντικές προόδους των τελευταίων ετών, η ταυτοποίηση των υψηλού κινδύνου ασθενών και η έγκαιρη αντιμετώπιση της σοβαρής σήψης παραμένει μια συνεχής ερευνητική πρόκληση.4 Στη σήψη έχουν μελετηθεί και προταθεί διάφοροι δείκτες σοβαρότητας και θνητότητας όπως βακτηριακοί παράγοντες, πρωτεΐνες οξείας φάσης (πρωτεΐνη C, προκαλσιτονίνη , LBP-LPS-binding protein), παράγοντες πήξης (fibrin degrading products, αντιθρομβίνη ΙΙΙ, dimerD),δείκτες κυτταρικής μεμβράνης (HLA-DR, CD-64, E-selectin), ορμόνες (cortisol, ACTH), διαλυτοί υποδοχείς(sCD-14, sTNFRI, sTNF-RII) και κυτοκίνες (TNF, IL-6, IL-8, IL-10). Όλοι αυτοί οι βιοδείκτες συμβάλλουν στη διάγνωση της σήψης, SIRS, και κάποιοι και προγνωστικά, χωρίς ωστόσο να έχουν την επιθυμητή ευαισθησία και ειδικότητα. Στη μελέτη μετρήθηκαν βιοδείκτες φλεγμονής και μεταβολικού προφίλ με σκοπό τόσο την επιβεβαίωση των ομάδων μη λοιμώδους SIRS, σήψης, και σηπτικής καταπληξίας, όσο και τη συσχέτισή τους με μοριακούς μεσολαβητές οι οποίοι παρέχουν προστασία έναντι του φλεγμονώδους στρες που είναι απειλητικό για τη ζωή. Βασιζόμενες στο γεγονός ότι οι HSP προάγουν τις ιντερλευκίνες (ILs) και διεγείρουν τα ανοσολογικά κύτταρα κατά την διάρκεια της συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης (SIRS), τελευταίες μελέτες επικεντρώνονται στις πρωτεΐνες θερμικής καταπληξίας ως μηχανισμών κύτταρο-προστασίας και πιθανώς ως δεικτών βαρύτητας της σήψης. Σε αντίθεση με πειραματικές μελέτες σε ζώα που δείχνουν προστατευτική επίδραση της HSP72 στη σήψη, οι μελέτες in vivo ή in vitrο σε ανθρώπους δεν είναι ξεκάθαρες, αναδεικνύοντας μια πιθανή προστατευτική σχέση ή μια συσχέτιση με την θνησιμότητα και τη νοσηρότητα. Παρόλο που η αυξημένη κυκλοφορία των HSP βοηθά στη μεταφορά των σημάτων κινδύνου στα φλεγμονώδη κύτταρα και στην ανοσολογική επιτήρηση, φαίνεται ότι οι HSP, κάτω από απροσδιόριστες συνθήκες, είναι πιθανόν να ασκούν βλαβερές επιδράσεις σε ορισμένες ασθένειες. Έτσι, η αύξηση των επιπέδων της εξωκυττάριας HSP72 που ανιχνεύθηκε στο πλάσμα παιδιών που εισήχθησαν σε ΜΕΘ Παίδων με σηπτικό σοκ συσχετίστηκε με χειρότερη έκβαση. Μια άλλη μεγάλου μοριακού βάρους (90kDa) επαγόμενη HSP (HSP90α), αλληλεπιδρά με 200 περίπου πρωτεΐνες πελάτες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής και μονοπάτια μεταγωγής σήματος των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών, ριβονουκλεοπρωτεινών, παραγόντων αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, παραγόντων μεταγραφής, και πρωτεϊνικών κινασών. Ο προστατευτικός ρόλος αυτής της σε αφθονία ευρισκόμενης στο κυτταρόπλασμα τσαπερόνης, είναι η έναρξη μιας ταχείας απάντησης σε αιφνίδιες προσβολές όπως το θερμικό σοκ, η υποξία, δραστικές μορφές οξυγόνου και αυξητικοί παράγοντες. Σε παράλληλη πορεία με τις αντιφατικές μελέτες του ρόλου της HSP72 σε ανθρώπους, έχει πρόσφατα δειχθεί ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού HSP90/Akt επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, προκαλώντας αύξηση του ρυθμού απόπτωσης σε σηπτικά ποντίκια. Ωστόσο, απουσιάζουν από τη διεθνή βιβλιογραφία μελέτες συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων της εξωκυττάριας HSP90α και κλινικών δεικτών έκβασης κατά την διάρκεια της οξείας φάσης της σοβαρής σήψης (SS) ή SIRS ή με προ- ή αντι-φλεγμονώδεις ιντερλευκίνες (IL), πρωτεΐνες της διαμεμβρανικής μεμβράνης πολυμορφοπυρήνων (nCD64), πρωτεΐνες οξείας φάσης ή με οξείες μεταβολικές διαταραχές στη φάση του στρες. Επίσης, δεν υπάρχουν μελέτες σε παιδιά ΜΕΘ που να συγκρίνουν τις HSP72 και HSP90α μεταξύ διαφορετικών κατηγοριών σοβαρών νοσημάτων ασθενών, συμπεριλαμβανομένου του μη λοιμώδους SIRS, ή να συσχετίζουν τα επίπεδά τους με την έκφραση της nCD64 της οξείας φάσης ή με πρώιμες μεταβολικές διεργασίες, ποικίλες ιντερλευκίνες και την ανάπτυξη MOSF.Σκοπός : Οι εξωκυττάριες HSP δρουν σαν επαγωγές ιντερλευκινών και διεγέρτες των ανοσολογικών κυττάρων κατά τη διάρκεια του συνδρόμου της συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (SIRS).Οι σημερινές γνώσεις σχετικά με τα μονοπάτια συναγερμού και την έκλυση των εξωκυττάριων HSP72 και HSP90α κατά την διάρκεια της οξείας φάσης της σήψης (S) ή σοβαρής σήψης (SS) δεν είναι πλήρεις. Στην παρούσα μελέτη μετρήθηκαν στον ορό τα επίπεδα των HSP90α, HSP72, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α και η έκφραση των CD64, CD11b σε παιδιά με σήψη ή σοβαρή σήψη σε σχέση με αυτά με τραύμα (SIRS) ή υγιή παιδιά(H). Η υπόθεση που εξέτασε η παρούσα έρευνα είναι ότι τα αυξημένα επίπεδα HSP90α θα μπορούσαν να ανιχνευθούν στον ορό των σοβαρά άρρωστων παιδιών, ιδιαίτερα σε εκείνα με σοβαρή σήψη και / ή σηπτικό σοκ, καθώς σε ένα βαθμό και σε παιδιά με μη λοιμώδες-SIRS σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Έτσι, συγκριτικά με την HSP72 που επίσης αναμένεται να είναι αυξημένη σε ασθενείς με SS, SIRS και MOSF, η εξωκυττάρια HSP90α θα μπορούσε να συσχετίζεται καλύτερα με το σύνδρομο πολυοργανικής ανεπάρκειας που χαρακτηρίζει τις βαρύτερες μορφές SS και SIRS, με το πρώιμο οξύ φλεγμονώδες και μεταβολικό στρες, με συστήματα βαθμολόγησης βαρύτητας νόσου, και χαρακτηριστικές παραμέτρους έκβασης. Ο σκοπός της μελέτης είναι να αναδείξει τη σημασία της αυξημένης έκφρασης των επιπέδων στον ορό ασθενών των HSP72 και 90, καθώς και τη συσχέτιση της αύξησης των αναφερόμενων δεικτών με το οξύ φλεγμονώδη και μεταβολικό στρες και με τη σοβαρότητα της νόσου.Μεθοδολογία: Μελετήθηκαν παιδιά με σήψη (n=20), σοβαρή σήψη (n=22), SIRS (n=23) και υγιή παιδιά (n=25).Αμέσως μετά την εισαγωγή στη ΜΕΘ Παίδων, ελήφθησαν καλλιέργειες αίματος, ούρων, φαρυγγικού, βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) και άλλες καλλιέργειες ιστών ως επί ενδείξεως καθώς και δείγματα ορού για μελέτη δεικτών της φλεγμονής. Οι HSP μετρήθηκαν με τη μέθοδο ELISA, οι ILs με χημειοφωταύγεια, και η έκφραση CD64 και CD11b σε ουδετερόφιλα με κυτταρομετρία ροής. Η σοβαρότητα της νόσου των παιδιών της μελέτης εκτιμήθηκε με τα συστήματα βαρύτητας νόσου Pediatric Risk of Mortality Score (PRISM), Therapeutic Intervention Scoring System (TISS) τροποποιημένο για παιδιά, Pediatric Logistic Organ Dysfunction Score (PELOAD) και το MOSF. Καταγράφηκαν χαρακτηριστικές παράμετροι έκβασης όπως η διάρκεια παραμονής στη ΜΕΘ (length of stay, LOS), ημέρες σε μηχανική υποστήριξη της αναπνοής (duration of mechanical ventilation, DOMV) και θνητότητα στη ΜΕΘ (PICU mortality). Η σήψη, σηπτική καταπληξία και SIRS ορίστηκαν σύμφωνα με την International Pediatric Consensus Conference. Η MOSF ορίστηκε με βάση τα κριτήρια του Wilkinson. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν αύξηση των επιπέδων των HSP90α και HSP72 συνοδευόμενα από παράλληλη αύξηση τωνIL-6, IL-8, IL10 και στις δυο ομάδες της σήψης σε σχέση με τα υγιή παιδιά. Στην ομάδα σοβαρής σήψης σημειώθηκε αύξηση HSP72, IL6 και TNF-α σε σχέση με το τραύμα(SIRS). Οι ασθενείς με SIRS παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα HSP90α, IL-6 και IL-8 σε σχέση με τους υγιείς (H).Η HSP72 σχετίστηκε αρνητικά με τους μεταβολικούς δείκτες και θετικά με τις TNF-α και nCD64. Μόνο η συσχέτιση με HDL (rs=-0.40, p<0.001) παρουσίασε στατιστική σημαντικότητα. Η HSP90α συσχετίστηκε θετικά με τις nCD64 (rs=0.48, p<0.001), διάφορες ιντερλευκίνες και πρωτεΐνες οξείας φάσης: IL-8 (rs=0.63, p<0.0001), IL-10 (rs=0.70, p<0.0001), CRP (rs=0.48, p<0.001), PCT (rs=0.50, p<0.001), PELOD (rs=0.72, p<0.0001),και LOS (rs=0.60, p<0.001), και αρνητικά με τις HDL(rs=-0.48, p<0.001) και LDL (rs=-0.37, p<0.01). Και οι δυο HSP αυξήθηκαν σημαντικά σε μη-επιζήσαντες και σε ασθενείς με MOSF. Οι HSP90α και HSP72 αυξήθηκαν στην ομάδα MOSF παράλληλα: α) με σημαντικές αυξήσεις των φλεγμονωδών βιοδεικτών nCD64, IL-6, CRP και PCT, β) με σημαντικές μειώσεις των μεταβολικών δεικτών (χοληστερόλης, HDL, LDL) αλλά όχι και γλυκόζης.Συμπεράσματα: Οι εξωκυττάριες HSP72 και HSP90α είναι σημαντικά αυξημένες στα βαριά πάσχοντα παιδιά, ειδικότερα στη σοβαρή σήψη. Για πρώτη φορά καταδεικνύεται ότι οι εξωκυττάριες HSP90α είναι σημαντικά αυξημένες σε βαριά άρρωστα παιδιά με SIRS, ιδιαίτερα όμως σε παιδιατρικούς ασθενείς με SS. Καταγράφεται σημαντική συσχέτιση της εξωκυττάριας τσαπεροκίνης HSP90α με την ανάπτυξη MOSF, φλεγμονώδους στρες, με τη σοβαρότητα της νόσου, δυσλειτουργία οργάνων, τη διάρκεια παραμονής στη ΜΕΘ, ημέρες σε αναπνευστήρα και την προβλεπόμενη θνητότητα. Καθώς οι HSP90α και HSP72 σχετίζονται αντίστροφα με ένα μεταβολικό πρότυπο χαμηλής-LDL/χαμηλής-HDL πρώιμης φλεγμονώδους σηπτικής διαταραχής, η αυξημένη εξωκυττάρια έκκρισης τους θα μπορούσε να διαδραματίζει το ρόλο ενός διαμεσολαβητή κατά την έναρξη της απάντησης του ξενιστή στη σοβαρή σήψη. Η τωρινή μελέτη ανοίγει το δρόμο για μελλοντικές μελέτες που θα διερευνήσουν περαιτέρω την κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ανοσολογική αντίδραση κατά τη διάρκεια της σοβαρής σήψης και SIRS με MOSF και ενδεχόμενα να οδηγήσει στον εντοπισμό νέων διαγνωστικών, προγνωστικών ή θεραπευτικών στόχων στη σοβαρή σήψη και τη γενικευμένη φλεγμονώδη αντίδραση στο στρες.