Διερεύνηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα και της διασποράς των υπεύθυνων γονιδίων σε πληθυσμούς των Bemisia tabaci (αλευρώδη) και Tetranychus urticae (τετράνυχου)

Abstract

Spider mite Tetranychus urticae and whitefly Bemisia tabaci are two of the mostdamaging pests in agriculture. Chemicals are the main way to control their populations.However, their extensive use is responsible for the selection of extremely high levels ofinsecticide/acaricide resistance for both species.We examined the levels of resistance in nine T. urticae populations from Greeceagainst a range of chemicals with different mode of actions. The majority of the populationsdisplayed high levels of resistance in at least one active ingredient. In one populationoriginating from a roses greenhouse we detected extremely high levels of resistance toabamectin. We examined the molecular mechanisms responsible for abamectin resistance,by employing a comprehensive approach including bioassays with synergists, biochemicalanalysis of detoxification pathways, use of RNAi via feedings with artificial diet, andmolecular analysis of target sites. We identified a novel mutation in the GluCl3 which wasstrongly correlated with resistance. We employed genetic crosses and single individualgenotyping to investigate the link between the mutation and the resistant phenotype, andconcluded that the mutation has a crucial role in abamectin resistance and is necessary forthe mite to survive at high concentrations of the chemical. Subsequently, moleculardiagnostics were developed for the detection of abamectin resistance in the field.Ten populations of the whitefly Bemisia tabaci collected from Crete, exhibitedresistance against different neonicotinoid insecticides. Laboratory selection with theneonicotinoids, imidacloprid and acetamiprid, was subsequently undertaken. The resistantstrains exhibited very high levels of resistance to thiacloprid (RR>900) and moderate levelsto imidacloprid (24 <RR< 56) and acetamiprid (9 <RR< 17). In vivo experiments withsynergists as well as biochemical assays with model substrates and RNAi via feeding withartificial diet were used to investigate the underlying mechanisms.The involvement of cytochrome P450 detoxification in resistance was indicated. RealTime PCR showed higher expression levels of the known neonicotinoid metaboliserCYP6CM1 in the resistant strains. However, this specific P450 has been strongly associatedwith resistance to imidacloprid and thiacloprid but not to acetamiprid, and thus theexistence of additional mechanism associated with neonicotinoid resistance is possible.In the last chapter of this thesis, we examined the presence and distribution ofknown target site resistance mutations in 33 T. urticae collections from 20 countries by sequencing. Those mutations were detected in variable frequencies and most of them had awide distribution all over the world.We subsequently looked at the evolutionary history of the resistantacetylcholinesterase (ace) alleles, looking at whether the resistance mutations arose in onelocation and spread globally or in different locations independently. The genetic backgroundof these mutations was examined by sequencing coding and non coding regions. Significantlevels of genetic variation were observed, however there was no correlation with theirgeographical region. Taking into account the number of different mutations or combinationof mutations and the fact that each mutation is associated with different geneticbackgrounds we concluded that mutations arose in different geographic locationsindependently, at least three times.

Ο τετράνυχος Tetranychus urticae και ο αλευρώδης Bemisia tabaci είναι δύο πολύσημαντικοί εχθροί των καλλιεργούμενων φυτών. Η χρήση χημικών σκευασμάτων αποτελείτον κύριο τρόπο ελέγχου των πληθυσμών, όπου η εκτεταμένη χρήση τους είναι υπεύθυνηγια εξαιρετικά υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας και για τα δύο είδη.Εκτιμήθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας 9 Ελληνικών πληθυσμών τετράνυχου σεεύρος σκευασμάτων με διαφορετικό τρόπο δράσης. Οι περισσότεροι πληθυσμοί εμφάνισανυψηλή ανθεκτικότητα σε τουλάχιστον μία δραστική ουσία. Σε πληθυσμό που συλλέχθηκεαπό θερμοκήπιο τριανταφυλλιάς εντοπίστηκαν πολύ υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στοabamectin. Μελετήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί που ήταν υπεύθυνοι για τηνανθεκτικότητα στο abamectin μέσω βιοδοκιμών με συνεργιστές, βιοχημική ανάλυση τωνμονοπατιών αποτοξικοποίησης, χρήσης RNAi μέσω τροφής με τεχνητή δίαιτα, και μοριακήανάλυση του στόχου. Εντοπίσαμε μια καινούρια μεταλλαγή στον τρίτο κανάλι χλωρίου(GluCl3) που σχετίστηκε ισχυρά με την ανθεκτικά. Με κλασικές μεθόδους γενετικής καιγονοτύπηση μεμονωμένων ατόμων αποδείχθηκε ότι η μεταλλαγή παίζει καθοριστικό ρόλοστην ανθεκτικότητα στο abamectin και είναι απαραίτητη για την επιβίωση του τετράνυχουσε υψηλές συγκεντρώσεις του σκευάσματος. Επιπροσθέτως, σχεδιάστηκαν μοριακάδιαγνωστικά για την έγκαιρη παρακολούθηση της ανθεκτικότητας του abamectin στοναγρό.Στον αλευρώδη, βρέθηκαν υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας σε διαφορετικάσκευάσματα νεονικοτινοειδών εντομοκτόνων, σε 10 πληθυσμούς που συλλέχθηκαν απότην Κρήτη. Ακολούθησε εργαστηριακή επιλογή με δύο νεονικοτινοειδή, imidacloprid καιacetamiprid, για την καλύτερη μελέτη των μηχανισμών ανθεκτικότητας. Στα ανθεκτικάστελέχη εντοπίστηκαν πολύ υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στο thiacloprid (RR > 900) καιμέτρια επίπεδα στα imidacloprid (24 <RR< 56) και acetamiprid (9 <RR< 17). In vivoπειράματα με ενζυμικούς παρεμποδιστές καθώς και βιοχημικά πειράματα με ενζυμικάυποστρώματα και RNAi μέσω τροφής με τεχνητή δίαιτα χρησιμοποιήθηκαν για διερεύνησητων μηχανισμών ανθεκτικότητας.Υποδείχτηκε συμμετοχή των P450s στην ανθεκτικότητα. Πειράματα Real Time PCRέδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης της γνωστής για τον ρόλο της στον μεταβολισμόνεονικοτινοειδών P450, CYP6CM1, στα ανθεκτικά στελέχη. Ωστόσο, η συγκεκριμένη P450έχει συσχετιστεί ισχυρά με την ανθεκτικότητα στα imidacloprid και thiacloprid αλλά όχι στο acetamiprid. Είναι πιθανή η ύπαρξη επιπρόσθετου μηχανισμού ανθεκτικότητας στανεονικοτινοειδή.Στο τελευταίο κεφάλαιο της διατριβής, εξετάστηκε η παρουσία και διασποράγνωστών μεταλλαγών ανθεκτικότητας στόχου σε 33 δείγματα τετράνυχων από 20 χώρες, μεαλληλούχιση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και οι συχνότητες των μεταλλαγώνανθεκτικότητας διέφεραν σημαντικά, οι περισσότερες από αυτές ήταν ευρύταταδιαδεδομένες γεωγραφικά σε πολλές περιοχές του κόσμου.Μελετήθηκε η εξελικτική προέλευση των μεταλλαγών της ακετυλοχολινεστεράσης(ace) προκειμένου να απαντηθεί το ερώτημα αν οι μεταλλαγές ανθεκτικότηταςεμφανίστηκαν σε μια περιοχή και εξαπλώθηκαν παγκοσμίως ή εμφανίστηκαν σεδιαφορετικές περιοχές ανεξάρτητα. Εξετάστηκε το γενετικό υπόβαθρο των μεταλλαγώναυτών μέσω αλληλούχισης τμήματος του γονιδίου της ace συμπεριλαμβανομένωνιντρονίων. Βρέθηκε σημαντική παραλλακτικότητα της ace, χωρίς συσχέτιση με τηνγεωγραφική κατανομή. Λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των διαφορετικών μεταλλαγών ήσυνδυασμό μεταλλαγών καθώς και το γεγονός ότι κάθε μεταλλαγή σχετίζεται μεδιαφορετικά γενετικά υπόβαθρά βγήκε το συμπέρασμα ότι οι μεταλλαγές εμφανίστηκαν σεδιαφορετικές γεωγραφικές περιοχές ανεξάρτητα, τουλάχιστον τρεις φορές.