Μελέτη φυσικών πλασμιδίων του αιθανολοπαραγωγού βακτηρίου Zymomonas mobilis

Abstract

The Gram-, ethanol-producer Zymomonas mobilis has attracted the interest of several research groupsduring recent decades for genetical improvement, in order to be used in extensive biotechnologicalapplications.In this work was achieved a more detailed analysis of three native plasmids pZMO1, pZMO2 andpZMO3, the so-called “small plasmids” of Zymomonas mobilis ATCC10988, focusing on finding thesequence of pZMO2 and identifying its functional properties. Also the results described here provideevidence that pZMO3 contains mobilization sequences.Finding the complete nucleotide sequence of pZMO2 revealed the existence of an open readingframe (ORF) encoding a replication protein (Rep) which is shown significant homology with replicasesof RCR plasmids and in specific those of the pC194/pUB110 family. The detection of single-strandedDNA, after hybridization under non-denaturing conditions, was further proof that pZMO2 uses theabove mechanism for its replication. Also identified the sequences responsible for this type ofreplication (SSO and DSO).Finally, mobilization ability was revealed for one of the three Z. mobilis plasmids tested.Mobilization is possibly conferred by an open reading frame of pZMO3 that codes for a predicted 66-kDa protein molecule – a putative mobilization protein. This protein maintains the 3H motif(HxDExxPHxh) at the N-terminus, which is conserved in Mob proteins belonging to the plasmid familypMV158 as well as the important amino acids Asp (D125) και Glu (E126). The origin of transfer (oriT),located upstream of the Mob protein, shows similar conformation with corresponding plasmid originsbelonging to the above family. Mobilization sequence of pZMO3 can be exploited for versatileapplications in vector engineering of this organism. Furthermore, the E. coli conjugation systemdescribed here may prove useful for detecting broad host range mobilization ability of new plasmidvectors.The findings of these plasmids which were found to share a little or no homology each other, modifyconsiderably the current beliefs on the content and the role of the Z. mobilis small plasmids and offer anew directions of research.

Το αιθανολοπαραγωγό Gram- βακτήριο Zymomonas mobilis έχει προσελκύσει τις τελευταίες δεκαετίεςτο ενδιαφέρον αρκετών ερευνητικών ομάδων, προκειμένου να βελτιωθεί γενετικά και ναχρησιμοποιηθεί σε εκτεταμένες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.Στην εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε μια πιο λεπτομερής ανάλυση των πλασμιδίων pZMO1,pZMO2 και pZMO3, των λεγόμενων και «μικρών πλασμιδίων» του Z. mobilis ATCC10988, εστιάζονταςστην εύρεση της πρωτοδιάταξης του pZMO2 και στη συνέχεια, στον προσδιορισμό των λειτουργικώνιδιοτήτων αυτού. Επίσης αποδείχθηκαν οι συζευκτικές ιδιότητες του pZMO3.Η εύρεση της πρωτοταγούς δομής του pZMO2 ανέδειξε την ύπαρξη ενός ανοικτού πλαισίουανάγνωσης (ORF) που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη αντιγραφής (Rep), αφού σύγκριση της αμινοξικήςτης αλληλουχίας με βάσεις δεδομένων έδειξε να υπάρχει σημαντική ομοιότητα με πρωτεΐνεςαντιγραφής πλασμιδίων που αντιγράφονται με το μηχανισμό του κυλιόμενου κύκλου και που ανήκουνστην οικογένεια pC194/pUB110-τύπου. Η ανίχνευση μονόκλωνου DNA, ύστερα από υβριδισμό κάτωαπό μη μετουσιωτικές συνθήκες, ήταν μια επιπλέον απόδειξη ότι το pZMO2 αντιγράφεται με τονπαραπάνω μηχανισμό. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν οι περιοχές που συμβάλουν στην αντιγραφήαυτού του τύπου (SSO και DSO) καθώς και η περιοχή λήξης της μεταγραφής.Σε ότι αφορά τις ικανότητες κινητοποίησης των τριών αυτών πλασμιδίων, βρέθηκε για πρώτηφορά ότι το pZMO3 περιέχει ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που κωδικοποιεί για μια πιθανή πρωτεΐνηκινητοποίησης (Mob), Μ.Β. 66 kDa, καθιστώντας το εν λόγω πλασμίδιο κινητοποιήσιμο. Η πρωτεΐνηαυτή διατηρεί το 3Η motif (HxDExxPHxh) στο Ν-τελικό άκρο της, το οποίο είναι συντηρημένο στιςαντίστοιχες πρωτεΐνες της οικογένειας πλασμιδίων pMV158-τύπου όπως επίσης και τα σημαντικά γιατη δράση της αμινοξέα Asp (D125) και Glu (E126). Αλλά και η περιοχή oriT, που βρίσκεται ανοδικά τηςΜοb πρωτεΐνης, παρουσιάζει ομοιότητα στη διαμόρφωσή της με τις αντίστοιχες περιοχές τωνπλασμιδίων της παραπάνω οικογένειας. Οι περιοχές αυτές κινητοποίησης του pZMO3 μπορούν ναχρησιμοποιηθούν για την κατασκευή πλασμιδιακών φορέων πολλαπλών χρήσεων για το Z. mobilis.Στα pZMO1 και pZMO2 αντίθετα δε βρέθηκαν παρόμοιες περιοχές.Τα ευρήματα των πλασμιδίων αυτών, που φέρουν περιοχές υπεύθυνες για την αντιγραφή τους, όπωςκαι ο εντοπισμός συζευκτικών ιδιοτήτων, τροποποιούν σημαντικά τις υπάρχουσες αντιλήψεις πάνωστα πλασμιδιακά πρότυπα του βακτηρίου και προσφέρουν νέο υλικό προς μελλοντική μελέτη.