Ειδικοί αλλοιωγόνοι μικροοργανισμοί και η επίδραση τους στην ποιότητα και στην τύχη των παθογόνων μικροοργανισμών στα αλιευτικά προϊόντα

Abstract

Microbial spoilage is the main mechanism of quality deterioration of fresh chilled fish. During the storage, only a small fraction of fish microbiota is responsible for spoilage, known as “specific spoilage organisms” or SSOs. Undoubtedly physical and chemical parameters are the most important factors that influence the growth and selection of microorganisms in a food ecosystem. However, the selection of the microbiota during food spoilage is not depended only on the environmental conditions, but also on microbial interactions. Microbial interaction among SSOs affects the growth of microorganisms and the fate of pathogens such as Listeria monocytogenes in foods.The purpose of the PhD thesis was to study the identity of the dominant spoilage microorganisms, their ability to produce metabolites that causing spoilage, the interaction among spoilage microorganisms and L. monocytogenes and the effect of antimicrobial adjuncts on safety and quality of fish products under storage at various temperature and atmosphere conditions.Initially, the spoilage profile of whole sea bream and sea bream fillets under different temperature conditions (0, 5, 15oC) and atmosphere (air and MAP) was investigated. The microbiota was studied by employing classical and molecular (culture dependent and culture independent) techniques. In the molecular-culture dependent techniques, bacterial isolates from the plates were identified by the 16S rRNA gene analysis and sequencing, while in the molecular culture independent techniques, prokaryotic DNA obtained directly from the fish flesh was determined by the gene 16S rRNA analysis, cloning and sequencing. Metabolic products (total volatile nitrogen, trimethylamine, biogenic amines and volatile metabolites) analysis was performed by using not only classical chemical analysis but also modern equipment such as HPLC309and SPME GC-MS to evaluate the potential chemical spoilage indicators of fish deterioration. The fate of L. monocytogenes alone or in co-culture with the main spoilage microorganisms was studied under air and MAP at 5oC, using model fish juice agar substrate. Finally, the fate of spoilage microbiota and L. monocytogenes was studied in presence of citrates as antimicrobial compounds.Pseudomonas spp. was found to be the dominant microorganisms on spoiled whole sea bream stored under air and MAP using both approaches. However, the molecular approach, based on 16S rRNA gene analysis, revealed that Pseudomonas fragi co-dominate with Carnobacterium maltaromaticum strain MMF-32 in fillets under ΜΑΡ at 5oC as well as Psychrobacter immobilis and Psychrobacter cryohalolentis in iced stored whole fish by molecular-culture dependent techniques. Moreover, Aeromonas clustering phylotypes found to co-dominate with Pseudomonas phylotypes by molecular-culture independent techniques. Therefore, molecular methods, such as 16S rRNA gene analysis is a powerful tool for studying food microbial ecology.Several volatile compounds were found to change during storage in both packages (air and MAP). Various compounds such as ethyl-2-methylbutyrate, ethyl isovalerate and ethyl tiglate were increased during storage in model fish substrate inoculated with Pseudomonas spp., while 3-hydroxy-1-butanone, 3-methyl-1-butanal, 2-methyl-1-butanal, isoamyl alcohol and 2-ethyl-1-hexanol were increased in model fish substrate inoculated with Lactic Acid Bacteria. The volatile compounds detected could be used as potential chemical indices of sea-bream fillets spoilage/freshness.Different atmospheric conditions affected the shelf-life and also the growth of SSOs in sea bream product. However, Pseudomonas spp. was found to be dominant microorganisms on spoiled sea bream under air and MAP conditions.310SSOs found to affect the fate of L. monocytogenes in sea bream products under air and MAP conditions. L. monocytogenes was increased in cases where Pseudomonas spp. dominated. Inhibition of spoilage bacteria under MA conditions found to allow better growth of L. monocytogenes. Therefore, MAP conditions seem to allow this pathogen to reach higher numbers compared to package under air.The dipping of sea bream fillets in sodium citrate solution was found to affect the growth of food spoilage bacteria in both packages and exhibited antibacterial activity against L. monocytogenes in fillets under MAP conditions. Shelf-life of sea bream fillets extended by 1 day in both packages. Additionally, the final population of L. monocytogenes found to be 1 log lower in fillets with citrate in contrast to fillets without citrate under MAP.

Η μικροβιακή αλλοίωση αποτελεί τον κυριότερο μηχανισμό υποβάθμισης της ποιότητας στους νωπούς ιχθύες. Κατά τη συντήρηση των αλιευμάτων, ένα μικρό κλάσμα της αρχικής μικροβιακής σύνθεσης γνωστό ως Ειδικοί Αλλοιωγόνοι Μικροοργανισμοί (ΕΑΜ) φθάνουν σε υψηλά αριθμητικά επίπεδα των 7-9 log cfu/g και παράγουν μεταβολίτες οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τις χαρακτηριστικές δυσάρεστες οσμές στα τρόφιμα και επομένως την οργανοληπτική απόρριψη. Η επιλογή των αλλοιωγόνων μικροοργανισμών εξαρτάται από τις επικρατούσες συνθήκες κατά τη συντήρηση όπως είναι η θερμοκρασία και η ατμόσφαιρα καθώς και από τις μικροβιακές αλληλεπιδράσεις. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των ΕΑΜ επιδρά στον ειδικό ρυθμό αύξησης και στο μέγεθος του τελικού πληθυσμού τους. Σε περίπτωση επιμόλυνσης με κάποιο παθογόνο, η τύχη του παθογόνου εξαρτάται και από τις αλληλεπιδράσεις αυτές.Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν μια ολοκληρωμένη προσέγγιση στο θέμα ποιότητα και ασφάλεια νωπών προιόντων τσιπούρας (ολόκληροι ιχθύες και φιλέτα) με τη διερεύνηση/ταυτοποίηση των αλλοιωγόνων μικροοργανισμών με χρήση μοριακών τεχνικών, την παρακολούθηση των μεταβολών της μικροβιακής αλληλουχίας καθώς και την παραγωγή μεταβολιτών λόγω μικροβιακής δραστηριότητας, την τύχη του Listeria monocytogenes από πιθανή επιμόλυνση καθώς και την επίδραση πρόσθετων εμποδίων στην τύχη των μικροοργανισμών (αλλοιωγόνων και παθογόνων).Ο προσδιορισμός της επικρατούσας μικροβιακής σύνθεσης των υπό εξέταση προϊόντων υπό διαφορετικές συνθήκες συντήρησης πραγματοποιήθηκε με χρήση κλασσικών και μοριακών (καλλιεργητικών και μη καλλιεργητικών) τεχνικών. Η ταυτοποίηση των βακτηρίων του ολικού μικροβιακού πληθυσμού έγινε με ανάλυση του γονιδίου 16S rRNA και αλληλούχιση (sequencing) σε απομονωμένες αποικίεςμικροοργανισμών από τα τρυβλία (μοριακές-καλλιεργητικές τεχνικές) και η διερεύνηση της μικροβιακής σύνθεσης με ανάλυση του γονιδίου 16S rRNA, κλωνοποίηση και αλληλούχιση σε προκαρυωτικό DNA απευθείας από τη σάρκα των ιχθύων (μοριακές-μη καλλιεργητικές τεχνικές). Η μελέτη των παραγόμενων μεταβολικών προϊόντων από τους αλλοιωγόνους μικροοργανισμούς (ολικό πτητικό άζωτο, τριμεθυλαμίνη, βιογενείς αμίνες και πτητικοί μεταβολίτες) πραγματοποιήθηκε με κλασσικές και ενόργανες κατά περίπτωση χημικές αναλύσεις (απόσταξη και τιτλοδότηση, φασματοφωτομετρία, HPLC, GC-MS SPME) με σκοπό να αξιολογηθούν ως πιθανοί χημικοί δείκτες αλλοίωσης. Οι πληθυσμιακές μεταβολές παρακολουθήθηκαν με τη χρήση κλασσικών μικροβιολογικών αναλύσεων.Η ανάλυση του γονιδίου 16S rRNA αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για τη διερεύνηση της μικροβιακής σύνθεσης στα αλιεύματα, καλύπτοντας την πληροφορία που διαφεύγει των κλασσικών τεχνικών. Τα Pseudomonas spp. βρέθηκε να αποτελούν το σημαντικότερο μέρος των κυρίαρχων αλλοιωγόνων μικροοργανισμών, τόσο σε προϊόντα ιχθύος αποθηκευμένα σε ατμόσφαιρα αέρα (φιλέτο, ολόκληρο) όσο και σε ΜΑΡ (φιλέτο μόνο) και με τις δύο προσεγγίσεις (κλασσική και μοριακή). Εξαίρεση αποτέλεσε η περίπτωση της συντήρησης των φιλέτων σε ΜΑΡ στους 5oC, όπου το μεγαλύτερο ποσοστό της μικροβιακής σύνθεσης αποτελούνταν από είδη/στελέχη των οξυγαλακτικών βακτηρίων με κυρίαρχο το Carnobacterium maltaromaticum strain MMF-32. Νέοι μικροοργανισμοί οι οποίοι συγκυριαρχούν με τα Pseudomonas spp. αποκαλύφθηκαν μέσω της μοριακής προσέγγισης. Στην ολόκληρη τσιπούρα στον πάγο (0oC), τα Pseudomonas spp. βρέθηκε να συγκυριαρχούν με το Aeromonas salmonicida strain CIP 57.50, όπως αποκαλύφθηκε με τις μοριακές-μη καλλιεργητικές τεχνικές (απευθείας εκχύλιση DNA από τη σάρκα του ιχθύος). Επίσης, τα Psychrobacterimmobilis και τα Psychrobacter cryohalolentis βρέθηκε να αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό της μικροβιακής σύνθεσης στην ολόκληρη τσιπούρα στον πάγο, σύμφωνα με τις μοριακές-καλλιεργητικές τεχνικές. Επομένως, οι μοριακές τεχνικές, ιδιαίτερα όταν το γονίδιο στόχος είναι το 16S rRNA, αναμφισβήτητα αποτελούν το σημαντικότερο εργαλείο για μελλοντική χρήση στην τεκμηρίωση της διασφάλισης της ποιότητας και της ασφάλειας ενός τροφίμου.Η μελέτη των πτητικών ουσιών που παράγονται από τους μικροοργανισμούς κατά τη διάρκεια της συντήρησης αποτελεί έναν εναλλακτικό τρόπο προσδιορισμού της πορείας της μικροβιακής αλλοίωσης διότι αρκετές από τις ουσίες αυτές αυξάνονται μεταξύ της πρώτης ημέρας και της ημέρας απόρριψης. Η ethyl-2-methylbutyrate, η ethyl isovalerate και η ethyl tiglate βρέθηκε να αυξάνονται εξαιτίας της δράσης των Pseudomonas spp., ενώ η 3-hydroxy-1-butanone, 3-methyl-1-butanal, 2-methyl-1-butanal, isoamyl alcohol και η 2-ethyl-1-hexanol εξαιτίας της δράσης των οξυγαλακτικών βακτηρίων, έπειτα από ανάλυση μοντέλων υποστρωμάτων ιχθύος ενοφθαλμισμένα σε μονοκαλλιέργεια με τους αντίστοιχους αλλοιωγόνους μικροοργανισμούς. Οι ουσίες αυτές θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως χημικοί δείκτες μικροβιακής αλλοίωσης της τσιπούρας. Η 3-methyl-butanal αποτέλεσε την σημαντικότερη ουσία η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως χημικός δείκτης νωπότητας/αλλοίωσης μικροβιακής προέλευσης. Η χρήση του TVB-N καθώς και των άλλων αζωτούχων μεταβολιτών (ΤΜΑ-Ν, βιογενείς αμίνες), ενώ αποτελούν έναν καλό δείκτη για την αποδοχή ή όχι, ωστόσο δεν επαρκούν για να χαρακτηρίσουν τη ‘φρεσκότητα’ του προϊόντος.Η αποθήκευση σε ΜΑΡ με το εμπορικό μίγμα αερίων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, βρέθηκε να επηρεάζει την αύξηση των αλλοιωγόνωνμικροοργανισμών σε σχέση με την αποθήκευση σε αερόβιες συνθήκες διότι προκάλεσε i) μείωση του ρυθμού αύξησης των Gram αρνητικών βακτηρίων, ii) αύξηση του ρυθμού αύξησης των Gram θετικών βακτηρίων (B. thermosphacta, οξυγαλακτικά βακτήρια) iii) αύξηση του τελικού πληθυσμού των Gram θετικών βακτηρίων και iv) μείωση του τελικού πληθυσμού των Gram αρνητικών βακτηρίων. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, η εφαρμογή του ΜΑΡ είχε ως αποτέλεσμα την τελική επικράτηση των Gram αρνητικών βακτηρίων, με ΕΑΜ τα Pseudomonas spp., και στις δύο ατμόσφαιρες (αέρας, ΜΑΡ) στις χαμηλές θερμοκρασίες.Η συγκαλλιέργεια μεταξύ των αλλοιωγόνων μικροοργανισμών μεταξύ τους αλλά και με το L. monocytogenes σε στερεά μοντέλα υποστρώματα ιχθύος έδειξε ότι ο ένας μικροοργανισμός επηρεάζει την αύξηση του άλλου. Οι αλλοιωγόνοι μικροοργανισμοί βρέθηκε να επιδρούν στην τύχη/συμπεριφορά του L. monocytogenes τόσο σε συσκευασία αέρα όσο και σε ΜΑΡ. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των ΕΑΜ βρέθηκε να επιδρά στον ειδικό ρυθμό αύξησης και στο μέγεθος του τελικού πληθυσμού τους. Η αύξηση του L. monocytogenes φάνηκε να ευνοείται στα φιλέτα σε συνθήκες αέρα όπου τα Pseudomonas spp. αποτελούν τον κυρίαρχο μικροοργανισμό. Επίσης, τα Shewanella spp. και οξυγαλακτικά βακτήρια, βρέθηκε να ευνοούν την αύξηση του παθογόνου στις συγκαλλιέργειες Sh-L, Lab-L στις συνθήκες αυτές. Η πτώση των πληθυσμών των Pseudomonas spp. και των Shewanella spp. εξαιτίας της επίδρασης του ΜΑΡ στην αύξησή τους βρέθηκε να επιτρέπει την αύξηση του L. monocytogenes σε επίπεδα λίγο υψηλότερα από αυτά που παρατηρούνται σε αερόβιες συνθήκες. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια παρεμποδίζουν την αύξηση του παθογόνου στις συνθήκες αυτές.Η προσθήκη κιτρικών αλάτων αποτελεί ένα επιπλέον εμπόδιο παρεμπόδισης της αύξησης των αλλοιωγόνων και των παθογόνων μικροοργανισμών. Η δράση του κιτρικού έναντι της αύξησης των αλλοιωγόνων μικροοργανισμών είχε ως αποτέλεσμα την επέκταση του εμπορικού χρόνου ζωής των ιχθύων κατά 1 ημέρα στις δύο ατμόσφαιρες. Επιπλέον, η δράση του κιτρικού έναντι της αύξησης του L. monocytogenes κυρίως στη συσκευασία ΜΑΡ είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του τελικού πληθυσμού του Listeria monocytogenes κατά 1 log σε σχέση με τα φιλέτα χωρίς το αντιμικροβιακό.