Study of the strain variability of the behavior of Salmonella enterica

Abstract

Intra-species variability of microbial behavior is an event with important implications for food safety research. Given this, and that the available research data on the variability among strains of Salmonella enterica are relatively few compared to other foodborne pathogens, the objective of the present research project was the assessment of the strain variability of three behavioral aspects of the pathogen: growth, inactivation and biofilm formation. For this purpose, 60 S. enterica strains belonging to various serotypes were studied. Aiming at the evaluation of the growth variability among S. enterica strains as affected by the growth environment, the kinetic behavior of the 60 strains of the pathogen was assessed at 37°C in tryptone soy broth of different pH values (4.3-7.0) and NaCl concentrations (0.5-6.0%). Maximum specific growth rate (μmax) values corresponding to each strain and growth condition were estimated by means of absorbance detection times of serially decimally diluted cultures using the automated turbidimetric system Bioscreen C. A total of 9,600 optical density curves were generated for the strains and the growth conditions tested. The variability of μmax among the S. enterica strains was important and greater than that observed within the strains (i.e., among replicates). Moreover, strain variability increased as the growth conditions became more stressful both in terms of pH and NaCl. A stochastic model providing μmax predictions as a function of pH and water activity (aw) and integrating intra-species variability data was then developed. For this purpose, growth kinetic data of the 60 S. enterica strains, generated during monitoring of growth in tryptone soy broth of different pH (4.0-7.0) and aw (0.964-0.992) values, were used. The effects of the environmental parameters on μmax were modelled for each tested S. enterica strain using cardinal type and gamma concept models for pH and aw, respectively. A multiplicative without interaction-type model, combining the models for pH and aw, was used to describe the combined effect of these two environmental parameters on μmax. The strain variability of the growth behavior of S. enterica was incorporated in the modelling procedure by using the cumulative probability distributions of the values of pHmin, pHopt and awmin as inputs to the growth model. The cumulative probability distribution of the observedμmax values corresponding to growth at pH 7.0-aw 0.992 was introduced in the place of the model’s parameter μopt. The introduction of the above distributions into the growth model resulted, using Monte Carlo simulation, in a stochastic model with its predictions being distributions of μmax values characterizing the strain variability. The developed model was further validated using independent growth kinetic data (μmax values) generated for the 60 strains of the pathogen at pH 5.0-aw 0.977, and exhibited a satisfactory performance. With regard to the inactivation behavior of S. enterica, the inherent acid and heat resistances of the 60 strains of the organism were assessed in tryptone soy broth without dextrose acidified to pH 3.0 or heated at 57°C. A total of 360 inactivation curves were generated. The acid inactivation rate (kacid) and the heat inactivation rate (kheat) was estimated using the log-linear model and a log-linear model with a “survival tail”, respectively. The strain variability of kacid was considerably higher than that of kheat, while no correlation was observed between the estimated values of these two inactivation kinetic parameters of the 60 S. enterica strains. Furthermore, no trends among the tested strains related to origin, serotype or antibiotic resistance profile were evident. The biofilm-forming ability of the 60 S. enterica strains was assessed at different pH values (3.8-7.0), NaCl concentrations (0.5-8.0%) and temperatures (4-37°C). A total of 4,320 biofilm formation tests (60 strains × 12 different environmental conditions × 6 replicates) were carried out. Biofilm formation was evaluated in tryptone soy broth after 48 h of incubation in polystyrene microtiter plates using crystal violet staining, and its quantification was based on the difference between the optical density measurements of the test and negative control (uninoculated) samples (ΔOD580nm). The tested strains formed biofilms under a wide range of environmental conditions, while extensive strain variability of this phenotypic response was observed. The strain variability of biofilm formation was affected by all three of the environmental parameters tested, and appeared to increase as the environmental conditions became less favorable for the organism. In addition, the increase in the strain variability caused by pH was found to be much greater than that caused by NaCl or temperature. The optimum conditions for biofilm formation, providing the maximum ΔOD580nm, varied significantly among the tested strains. Among the evaluated conditions, most of the S. enterica strains were clustered as forming their highest amount of biofilm at pH 5.5, at 0.5% NaCl and at 25°C. No relationships were observed between the biofilm-forming ability of the strains and their serotype or their growth kinetic behavior as this was evaluated previously. The data generated in the studies described in the present thesis is expected to be useful in advancing the current understanding of strain variability, as well as in strain selection for use in food safety challenge studies. Moreover, the collected data should be valuable in describing and integrating the strain variability of S. enterica behavior in quantitative microbiology and microbial risk assessment.

Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της μικροβιακής συμπεριφοράς είναι ένα γεγονός μεγάλης σημασίας για την έρευνα της ασφάλειας των τροφίμων. Δεδομένου αυτού, καθώς και του ότι τα διαθέσιμα ερευνητικά δεδομένα για τη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του παθογόνου Salmonella enterica είναι λίγα συγκριτικά με άλλα τροφoγενή παθογόνα, το αντικείμενο της παρούσας έρευνας ήταν η αξιολόγηση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας τριών βασικών πτυχών της συμπεριφοράς του παθογόνου: της αύξησης, της αδρανοποίησης και της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου. Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκαν 60 στελέχη S. enterica, ανήκοντα σε διάφορους ορότυπους. Στοχεύοντας στην αξιολόγηση της παραλλακτικότητας αύξησης μεταξύ στελεχών S. enterica ως συνάρτηση του περιβάλλοντος αύξησης, η κινητική συμπεριφορά των 60 στελεχών του παθογόνου αξιολογήθηκε στους 37°C σε θρεπτικό ζωμό tryptone soy broth με διαφορετικές τιμές pΗ (4.3-7.0) και συγκεντρώσεις NaCl (0.5-6.0%). Οι τιμές του μέγιστου ειδικού ρυθμού αύξησης (μmax) του κάθε στελέχους και για κάθε συνθήκη αύξησης προσδιορίστηκαν με βάση χρόνους ανίχνευσης απορρόφησης διαδοχικά και δεκαδικά αραιωμένων καλλιεργειών χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο σύστημα μέτρησης απορρόφησης Bioscreen C. Συνολικά παρήχθησαν 9600 καμπύλες οπτικής πυκνότητας. Η παραλλακτικότητα του μmax μεταξύ των στελεχών S. Enterica ήταν σημαντική και μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε εντός των στελεχών (μεταξύ των επαναλήψεων). Επιπλέον, η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα αυξήθηκε όταν οι συνθήκες έγιναν περισσότερο δυσχερείς για την αύξηση του παθογόνου, τόσο σε επίπεδο pH όσο και NaCl. Ένα στοχαστικό μοντέλο το οποίο, ενσωματώνοντας τα δεδομένα διαστελεχιακής παραλλακτικότητας, παρέχει προβλέψεις μmax ως συνάρτηση του pΗ και της ενεργότητας νερού (aw) αναπτύχθηκε στη συνέχεια. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιηθήκαν κινητικά δεδομένα αύξησης των 60 στελεχών S. enterica, τα οποία παρήχθησαν κατά την παρακολούθηση της αύξησης του παθογόνου σε tryptone soy broth διαφορετικών τιμών pH (4.0-7.0) και aw (0.964-0.992). Οι επιδράσεις των περιβαλλοντικών παραμέτρων στον μmax μοντελοποιήθηκαν για κάθε στέλεχος S. Enterica χρησιμοποιώντας κατάλληλα για κάθε παράμετρο δευτερογενή μοντέλα. Ένα πολλαπλασιαστικό χωρίς αλληλεπιδράσεις μοντέλο, το οποίο συνδυάζει τα μοντέλα για το pH και την aw, χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει την συνδυασμένη επίδραση αυτών των δύο περιβαλλοντικών παραμέτρων στον μmax. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της αυξητικής συμπεριφοράς του παθογόνου S. Enterica ενσωματώθηκε στη διαδικασία μοντελοποίησης εισάγοντας τις αθροιστικές κατανομές πιθανότητας των τιμών pHmin, pHopt και awmin στο μοντέλο αύξησης. Η αθροιστική κατανομή πιθανότητας των παρατηρούμενων τιμών μmax σε pH 7.0-aw 23 0.992 εισήχθη στο μοντέλο στη θέση της παραμέτρου μopt. Η εισαγωγή των παραπάνω κατανομών στο μοντέλο αύξησης οδήγησε, μέσω της χρήσης προσομοίωσης Monte Carlo, σε ένα στοχαστικό μοντέλο αύξησης του οποίου οι προβλέψεις είναι κατανομές τιμών μmax, με τις τελευταίες να χαρακτηρίζουν τη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της αύξησης του παθογόνου. Το αναπτυχθέν μοντέλο στη συνέχεια αξιολογήθηκε έναντι ανεξάρτητων κινητικών δεδομένων αύξησης (δεδομένα μmax) για τα 60 στελέχη S. enterica σε pH 5.0-aw 0.977, και επέδειξε ικανοποιητική επίδοση. Αναφορικά με τη συμπεριφορά αδρανοποίησης του παθογόνου S. enterica, οι εγγενείς οξυ- και θερμο-ανθεκτικότητες των 60 στελεχών αξιολογήθηκαν σε tryptone soy broth χωρίς δεξτρόζη οξινισμένου σε pH 3.0 ή θερμισμένου στους 57°C. Συνολικά παρήχθησαν 360 καμπύλες αδρανοποίησης. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του ρυθμού όξινης αδρανοποίησης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε για το ρυθμό θερμικής αδρανοποίησης, ενώ καμία συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ αυτών των δύο κινητικών παραμέτρων. Επιπρόσθετα, καμία τάση μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών σε σχέση με την προέλευση, τον ορότυπο ή την ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά δεν ήταν εμφανής. Η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου των 60 στελεχών S. enterica αξιολογήθηκε σε διαφορετικές τιμές pH (3.8-7.0), συγκεντρώσεις NaCl (0.5-8.0%) και θερμοκρασίες (4-37°C). Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 4320 δοκιμές σχηματισμού βιοϋμενίων (60 στελέχη × 12 διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες × 6 επαναλήψεις). Ο σχηματισμός βιοϋμενίου προσδιορίστηκε σε tryptone soy broth μετά από 48 h επώασης εντός πλαστικών μικροπλακετών ειδικού σχεδιασμού, χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους, και η ποσοτικοποίησή του στηρίχτηκε στη διαφορά μεταξύ της μετρούμενης οπτικής πυκνότητας των υπό εξέταση δειγμάτων και αρνητικών (μη εμβολιασμένων) μαρτύρων (ΔOD580nm). Τα εξεταζόμενα στελέχη σχημάτισαν βιοϋμένια σε μία ποικιλία περιβαλλοντικών συνθηκών, ενώ εκτεταμένη ήταν η παρατηρούμενη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα αυτής της φαινοτυπικής απόκρισης. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του σχηματισμού βιοϋμενίου επηρεάστηκε και από τις τρεις περιβαλλοντικές παραμέτρους που εξετάστηκαν, και φάνηκε να αυξάνεται όσο οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνονταν λιγότερο ευνοϊκές για το παθογόνο. Επιπλέον, η αύξηση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας που προκλήθηκε από το pΗ ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτήν που προκλήθηκε από το NaCl ή τη θερμοκρασία. Οι βέλτιστες συνθήκες για σχηματισμό βιοϋμενίου, οδηγώντας στη μέγιστη ΔOD580nm, ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών. Μεταξύ των συνθηκών που αξιολογήθηκαν, τα περισσότερα από τα στελέχη S. enterica σχημάτισαν τη μεγαλύτερη ποσότητα βιοϋμενίου σε pH 5.5, σε 0.5% NaCl και στους 25°C. Καμία σχέση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου των στελεχών και του ορότυπου τους, ή της κινητικής συμπεριφοράς αύξησής τους όπως αυτή είχε αξιολογηθεί προηγουμένως. Τα δεδομένα τα οποία παρήχθησαν στις μελέτες οι οποίες περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αναμένεται να είναι χρήσιμα στη βελτίωση της κατανόησης της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας, καθώς και στην επιλογή στελεχών με στόχο τη χρήση τους σε μελέτες πρόκλησης σχετικών με την ασφάλεια των τροφίμων. Επιπλέον, τα πειραματικά δεδομένα της συγκεκριμένης διατριβής έχουν αξία για την περιγραφή και την ενσωμάτωση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας της συμπεριφοράς του παθογόνου S. enterica στην ποσοτική μικροβιολογία και στον προσδιορισμό μικροβιακής επικινδυνότητας.