Διερεύνηση αντιμικροβιακής αντοχής και παθογονικότητας νοσοκομεικακών στελεχών ψευδομονάδων

Abstract

Pseudomonas is a genus of Gram negative, strict aerobic and oxidase positive bacteria. Pseudomonas aeruginosa is a major cause of severe nosocomial and community acquired infections. The last decade, the rate of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa strains is high, complicating treatment. One of the most common mechanism of carbapenem resistance in P. aeruginosa is the production of carbapenem hydrolyzing enzymes. The aim of our study was a) the phenotypic and molecular detection of metallo-b- lactaamse as a resistance mechanism to carbapenems in multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa strains, b) the investigation of the genetic environment of the genes responsible for the production of the carbapenemase, c) molecular typing and d) the study of virulence of those multi-drug resistant strains.Three hundred and eighty-seven P. aeruginosa isolates resistant to carbapenems were collected from two different hospitals in Greece (University hospital of Larissa and General Hospital of Chest Diseases “Sotiria”). One hundred and twenty-six were positive for the production of metallo-β-lactamase according to the phenotypic and molecular screening. We undertook molecular typing to identify the clonality of carbapenemase producing P. aeruginosa in Greek hospitals and to assess whether there were differences between different hospitals. Virulence of representative isolates from different STs was assessed in an in vivo pathogenicity model.During an eight-month period, from March to October 2011, 813 P. aeruginosa strains were isolated in total. 387 of these (47,6%) were resistant to carbapenems (MIC>=8μg/ml according to CLSI, 2012), while 126 (32,5%) were positive for the production of metallo-b-lactamase according to the phenotypic screening. All isolates were MBL-producers containing blaVIM within class 1 integrons in association with other genes encoding resistance to other antimicrobial agents. The sequencing analysis revealed that 80 isolates contain the allele blaVIM-2, 36 the allele blaVIM-4, 9 the allele blaVIM-1and only one the allele blaVIM-17.Sequence types (ST) were assigned by Multi-locus Sequence Typing (MLST) and nine STs–ST111 (n=60), ST235 (45), ST395 (7) ST244 (4), ST308 (3), ST277 (3), ST773 (2), ST253 (1) and ST 1457 (1) were found.Virulence of representative isolates from the most prevalent STs was assessed in a G. mellonella – P. aeruginosa pathogenicity model. Isolates belonging to ST111 and ST235 were the most frequent strains and were less virulent than other carbapenem resistant isolates belonging to different STs. In conclusion:1.The rate of carbapenem resistance is quite high (47,6%) in Greek Hospitals2.Major cause of resistance in carbapenems in P. aeruginosa isolates is the production of metallo-b-lactamases, blaVIM, within integrons class I.3.Most of the isolates belong to MLST clones ST111 and ST 235.4.It is very important to find new methods for the detection of carbapenemase-producing isolates in order to be able to eliminate the spread. Modified MALDI-TOF MS is a method with high sensitivity and specificity for the detection of Ps. aeruginosa- producing carbapenemase. Blue-Carba is a very cheap and reliable phenotypic method, based on the hydrolyses of the antibiotic, that could be used in any laboratory.5.There are differences in virulence between different clones without any correlation with the presence of virulence genes of the Type III Secretion System. Most prevalent STs revealed with attenuated virulence enhancing their capacity for colonisation and onward transmission.

Οι ψευδομονάδες είναι αζυμωτικά Gram αρνητικά βακτηρίδια, αυστηρά αερόβια και οξειδάση θετικά. Η Pseudomonas aeruginosa αποτελεί κυρίως αίτιο σοβαρών και ποικίλων νοσοκομειακών λοιμώξεων αλλά και λοιμώξεων της κοινότητας, οι οποίες συνήθως είναι ηπιότερες. Την τελευταία δεκαετία έχει παρατηρηθεί μεγάλη αύξηση των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών Pseudomonas aeruginosa, γεγονός που αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στην αντιμετώπιση αυτών των λοιμώξεων, καθώς οι θεραπευτικές επιλογές που απομένουν είναι ελάχιστες. Ο κυριότερος μηχανισμός αντοχής είναι η παραγωγή καρβαπενεμασών, ενζύμων δηλαδή που υδρολύουν τις καρβαπενέμες.Σκοπός της εργασίας μας ήταν α) η φαινοτυπική και μοριακή ανίχνευση των μεταλλο-β-λακταμασών ως επίκτητου μηχανισμού αντοχής στις καρβαπενέμες πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa β) η μελέτη του γενετικού περιβάλλοντος των γονιδίων που κωδικοποιούν καρβαπενεμάση και ο χαρακτηρισμός των ιντεγκρονίων, γ) η μοριακή τυποποίηση των στελεχών αυτών και δ) η μελέτη της παθογονικότητας των επικρατούντων κλώνων.Για το λόγο αυτό μελετήσαμε 387 στελέχη από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας και από το Νοσοκομείο «Η Σωτηρία» της Αθήνας από τα οποία τα 126 βρέθηκαν θετικά στην παραγωγή καρβαπενεμάσης τόσο φαινοτυπικά όσο και μοριακά. Συγκεκριμένα, έγινε φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής καρβαπενεμασών με διάφορες μεθόδους όπως και προσδιορισμός των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή τους με μοριακές μεθόδους, ενώ παράλληλα μελετήθηκε και το γενετικό τους περιβάλλον. Ακολούθησε τυποποίηση των εν λόγω στελεχών με MLST και σύγκριση των κλώνων στα δύο νοσοκομεία. Επιπλέον, μελετήθηκε η παθογονικότητα των επικρατέστερων κλώνων, με πειράματα in vivo. Κατά το χρονικό διάστημα από τον Μάρτιο έως και τον Οκτώβριο του 2011 απομονώθηκαν συνολικά 813 στελέχη Pseudomonas aeruginosa εκ των οποίων 387 (47,6%) παρουσίασαν αντοχή στις καρβαπενέμες (MIC>8μg/ml) σύμφωνα με τα κριτήρια του CLSI, 2012. Από τα 387 ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη, 126 (32,5%) βρέθηκαν θετικά με τις διάφορες φαινοτυπικές δοκιμασίες δηλώνοντας την παρουσία μέταλλο-β-λακταμάσης (τάξης Β) ενώ ανιχνεύτηκαν διάφορα αλληλόμορφα γονίδια της καρβαπενεμάσης VIM. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου blaVIM, που ακολούθησε, κατέδειξε ότι από τα 126 στελέχη, τα 80 έφεραν το αλληλόμορφο blaVIM-2, τα 36 το αλληλόμορφο blaVIM-4, τα 9 το αλληλόμορφο blaVIM-1και σε 1 στέλεχος το αλληλόμορφο blaVIM-17.Σε όλα τα στελέχη το γονίδιο blaVIM βρέθηκε να αποτελεί τμήμα της γονιδιακής συστοιχίας ιντεγκρονίων τάξης 1, γενετικών δομών που έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση πολυανθεκτικού φαινοτύπου, καθώς είναι ικανές να συσσωρεύουν γονίδια ανθεκτικότητας έναντι διαφόρων τάξεων αντιβιοτικών. Στη συνέχεια η τυποποίηση των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa που διενεργήθηκε με τη μέθοδο MLST, ανέδειξε ότι τα στελέχη P. aeruginosa άνηκαν σε 9 διαφορετικούς STs τύπους και συγκεκριμένα στους ST-111, ST-235, ST-244, ST-253, ST-277, ST-308, ST-395, ST-773 και ST-1457.Η μελέτη της παθογονικότητας αντιπροσωπευτικών MLST στελεχών P. aeruginosa πραγματοποιήθηκε στο μη σπονδυλωτό μοντέλο Galleria mellonella. H Galleria mellonella αποτελεί ένα κατάλληλο μη θηλαστικό μοντέλο-ξενιστή για τη μελέτη του ρόλου του Type III Secretion System στη παθογένεση των ψευδομονάδων. Όλα τα στελέχη αναδείχθηκαν θετικά για τα γονίδια exoT και exoY ενώ διαφορές υπήρχαν στα γονίδια exoS και exoU. Τα υπό μελέτη στελέχη εμφάνισαν διαφορές στη παθογονικότητα. Συγκεκριμένα οι κλώνοι ST111 και ST235 οι οποίοι επικρατούν, αναδείχθηκαν οι λιγότερο παθογονικοί με ποσοστό επιβίωσης των προνυμφών μεγαλύτερο του 50% το πρώτο 24ωρο ενώ οι ST277, ST244 και ST773 αναδείχθηκαν οι πιο παθογονικοί με ποσοστό επιβίωσης 0% στις πρώτες 24 ώρες, παρόμοιο με αυτό των πρότυπων στελεχών.Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα:1.Το ποσοστό των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa στα ελληνικά νοσοκομεία για το χρονικό διάστημα που εξετάσαμε ήταν πολύ υψηλό (47,6%), ενώ παράλληλα εμφάνιζαν πολυανθεκτικούς φαινοτύπους, περιορίζοντας τις θεραπευτικές επιλογές2.Η ανθεκτικότητα στις καρβαπενέμες των στελεχών P. aeruginosa οφείλεται σε αρκετά μεγάλο ποσοστό (32,5%) στην παρουσία των αλληλομόρφων του γονιδίου VIM (VIM-1, VIM-2, VIM-4 και VIM-17), τα οποία διαπιστώθηκε ότι εδράζονται επί ιντεγκρονίων, γενετικών δομών με ικανότητα ενσωμάτωσης και άλλων γονιδίων που προσδίδουν αντοχή και σε άλλες τάξεις αντιβιοτικών.3.Η πλειονότητα των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών P. aeruginosa άνηκαν στους ST-111MLST και ST-235MLST4.Αποτελεί επιτακτική ανάγκη η εύρεση μεθόδων για την άμεση ανίχνευση των στελεχών που παράγουν καρβαπενεμάσες έτσι ώστε να εμποδίζεται η διασπορά. Ανάμεσα στις μεθόδους ανίχνευσης, η τροποποιημένη MALDI-TOF MS αποτελεί μία μέθοδο με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα στην ανίχνευση των ψευδομονάδων που παράγουν καρβαπενεμάση ενώ η δοκιμασία Blue-Carba αποτελεί μια φτηνή, γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδο για την ανίχνευση των ψευδομονάδων που παράγουν καρβαπενεμάσες, που θα μπορούσε να εφαρμοσθεί σε οποιοδήποτε εργαστήριο χωρίς ιδιαίτερο εξοπλισμό.5.Υπάρχουν διαφορές στην παθογονικότητα των στελεχών που ανήκουν σε διαφορετικούς STs που δε σχετίζονται με την παρουσία συγκεκριμένων γονιδίων παθογονικότητας του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ. Οι πιο συχνοί MLST τύποι φαίνεται να σχετίζονται με μειωμένη παθογονικότητα εύρημα που πιθανότατα συσχετίζεται με την ικανότητα τους να διασπείρονται και να επικρατούν έναντι των υπολοίπων.