Μελέτη μηχανισμών αντοχής πολυανθεκτικών στελεχών pseudomonas aeruginosa στις καρμπαπενέμες με φαινοτυπικές και μοριακές μεθόδους

Abstract

Pseudomonas aeruginosa has the potential to achieve resistance to carbapenems via the acquisition of carbapenemase-encoding genes, the down-regulation or loss of the OprD porin, the overexpression of efflux systems and the overproduction of cefalosporinases. In the present study, 30 multi-drug-resistant and carbapenem resistant isolates according to the VITEK2 system from 2003-2006 and 150 isolates with the same characteristics from 2008-2011 isolated from patients hospitalized in various wards of Hippokration General Hospital of Thessaloniki were screened for carbapenemase production, OprD porin loss, efflux overexpression and the presence of inducible AmpC beta-lactamases. Carbapenem resistance in the hospital setting was common and carbapenem use remained high during the entire study period. All isolates were screened phenotypically for metallo-beta-lactamase production (Ambler class B carbapenemases), Ambler class A carbapenemase production, inducible AmpC production and efflux pumps overexpression using the EDTA test, Double Disc Synergy Test (DDST), D-test and CCCP-test, respectively. The OprD porin loss was assessed with SDS-PAGE. Isolates presenting positive EDTA test were screened with molecular methods (PCR and sequencing) for IMP-, VIM- and NDM-type carbapenemases. Isolates showing positive DDST were initially tested for the presence of KPC and GES/IBC and afterwards for TEM and SHV beta-lactamases. Imipenem and meropenem MIC values were determined with the broth microdilution reference method. The MIC values were used to calculate the MIC50 and MIC90 as well as the geometric mean of imipenem and meropenem for both study groups. The clonal relatedness of metallo-beta-lactamase producers was determined with ERIC 2 PCR. The prevalence of the VIM-2 carbapenemase-encoding gene was high in both study groups (50% for 2003-2006 and 49,3% for 2008-2011) whereas no other carbapenemase was found. Efflux overexpression was detected in 13,33% and in 24% of the study isolates of the 2003-2006 and 2008-2011 groups, respectively. OprD porin loss was found in 50% of the 2003-2006 and in 62,3% of the 2008-2011 isolates and the presence of inducible AmpC was 50% and 52,74% for 2003-2006 and 2008-2011 isolates, respectively. Further data analysis showed statistically significant accumulation of various resistance mechanisms among VIM-2-producers isolated between 2008 and 2011 with a parallel raise in imipenem MIC90 and the geometric mean of imipenem and meropenem MIC values between the two study groups. The accumulation of carbapenem resistance mechanisms, apparently unnecessary for its survival, highlights the potential of this formidable pathogen for evolutionary success under antibiotic selective pressure.

Η P. aeruginosa διαθέτει την ικανότητα ανάπτυξης αντοχής στις καρμπαπενέμες μέσω της πρόσληψης γονιδίων που κωδικοποιούν καρμπαπενεμάσες, τη μειωμένη έκφραση ή απώλεια της πορίνης OprD, την υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής και την υπερπαραγωγή κεφαλοσπορινασών. Στην παρούσα μελέτη, 30 στελέχη πολυανθεκτικά και ανθεκτικά στις καρμπαπενέμες σύμφωνα με το σύστημα VITEK2 που απομονώθηκαν την περίοδο 2003-2006 και 150 στελέχη με τα ίδια χαρακτηριστικά που απομονώθηκαν την περίοδο 2008-2011 από διάφορα τμήματα του Γ.Ν.Θ. «Ιπποκράτειο» μελετήθηκαν ως προς την παραγωγή καρμπαπενεμασών, την απώλεια της πορίνης OprD, την υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής και την ύπαρξη επαγώγιμων AmpC β-λακταμασών. Τα ποσοστά αντοχής στις καρμπαπενέμες και η χρήση των καρμπαπενεμών στο νοσοκομείο διατηρήθηκαν σε υψηλά επίπεδα καθ’ όλη τη χρονική περίοδο απομόνωσης των στελεχών. Όλα τα στελέχη ελέγχθηκαν φαινοτυπικά για την παραγωγή μεταλλο-β-λακταμασών (καρμπαπενεμάσες τάξης Β κατά Ambler), καρμπαπενεμασών τάξης Α κατά Ambler, επαγώγιμης παραγωγής AmpC β-λακταμασών και υπερεκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής με EDTA test, Double Disc Synergy Test (DDST), D-test και CCCP-test, αντίστοιχα. Η απώλεια της πορίνης OprD μελετήθηκε με SDS-PAGE. Τα στελέχη με θετικό EDTA test ελέγθηκαν μοριακά (PCR και αλληλούχηση) ως προς την παραγωγή IMP-, VIM- και NDM-τύπου μεταλλο-β-λακταμασών. Τα στελέχη με θετικό DDST ελέγχθηκαν αρχικά για την παραγωγή της KPC και GES/IBC και στη συνέχεια για την παραγωγή TEM και SHV β-λακταμασών. Η τιμή της MIC της ιμιπενέμης και της μεροπενέμης για κάθε στέλεχος καθορίστηκε με τη μέθοδο αναφοράς των μικροαραιώσεων σε ζωμό. Από τις τιμές των MICs υπολογίστηκαν οι MIC50 και οι MIC90 καθώς και ο γεωμετρικός μέσος όρος για την ιμιπενέμη και τη μεροπενέμη σε κάθε ένα από τα δύο δείγματα της μελέτης. Η κλωνική συγγένεια στελεχών που παρήγαγαν μεταλλο-β-λακταμάση ελέγχθηκε με τη διενέργεια ERIC 2 PCR. Το γονίδιο VIM-2 βρέθηκε σε υψηλά ποσοστά τόσο στο δείγμα 2003-2006 (50%) όσο και στο δείγμα 2008-2011 (49,3%) ενώ, καμία άλλη καρμπαπενεμάση δεν ανιχνεύθηκε. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής βρέθηκε σε ποσοστό 13,33% στο δείγμα 2003-2006 και 24% στο δείγμα 2008-2011, απώλεια της πορίνης OprD σε ποσοστό 50% στο δείγμα 2003-2006 και 62,3% στο δείγμα 2008-2011 και ύπαρξη επαγώγιμης AmpC σε ποσοστό 50% στο δείγμα 2003-2006 και 52,74% στο δείγμα 2008-2011. Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν στατιστικά σημαντική συσσώρευση μηχανισμών αντοχής μεταξύ των στελεχών της περιόδου 2008-2011 που έφεραν το γονίδιο για την VIM-2 καρμπαπενεμάση. Παράλληλα, παρατηρήθηκε αύξηση της MIC90 της ιμιπενέμης και του γεωμετρικού μέσου όρου των τιμών των MICs της ιμιπενέμης και της μεροπενέμης στο νεότερο εκ των δύο δειγμάτων. Η συσσώρευση μηχανισμών αντοχής, η οποία φαινομενικά δεν είναι απαραίτητη για την άμεση επιβίωσή της, καταδεικνύει τις αξιοθαύμαστες δυνατότητες της P. aeruginosa για εξελικτική επιτυχία υπό την πίεση της φυσικής επιλογής που ασκείται μέσω των αντιβιοτικών.