Ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της p53/PUMA κυτταρικής οδού σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου σταδίου ΙΙ η ΙΙΙ κατά ΤΝΜ

Abstract

AIM: The purpose of the study was to investigate, in tumors of patients with colon cancer TNM stage II and III, the immunohistochemical (IHC) expression of a series of protein markers involved in apoptotic PUMA/p53 pathway using the method of tissue microarrays. Additionally we assessed the relationship of the studied indicators with clinicopathological characteristics and with prognosis.MATERIAL AND METHODS: We used paraffin tissue blocks containing tumor, normal tissue and metastatic lymph node from 130 patients with colon cancer stage II and III. We studied by IHC and using the HistoScore the PUMA, p53, Ki-67, BAD, BID, Bcl2 and MDM2 proteins. χ2 or Fisher’s exact tests and Mann-Whitney or Kruskall-Wallis tests were used to test associations between protein expression and different categorical clinicopathological variables. Survival probabilities were estimated by the Kaplan-Meier. For the multivariate analyses of the prognostic markers, model choice was performed using backward selection criteria with P<0.15. RESULTS: 39 patients had cancer in right colon, 52 in left colon and 39 in rectum. In 88 cases administered postoperative chemotherapy. Median follow up time was 54 months (range: 1-81) and the 3-year survival (CSS) was 70.8%. The majority of tumors showed moderate histologic differentiation, 50% was stage B2 (Astler-Coller). Lymphatic invasion detected in 30% of cases, while 50% was free of nodal metastases. Statistically significant correlations emerged between BAD/ BID, PUMA/ BAD, PUMA/ Ki-67 and p53/ MDM2. There was a statistically significant difference in overexpression of BAD, BID, PUMA, Ki-67 and p53 in cancer tissue compared to normal tissue, whereas the Bcl2 expression was higher in normal. Statistically significant associations observed between Bcl-2 and tumor differentiation, BAD and tumor localization, p53 and number of infiltrated lymph nodes, BID/Mdm2 and maximal tumor diameter and Ki-67 with mucinous adenocarcinomas. Smaller CSS, DFS and OS showed patients with lymphatic invasion and ≥4 infiltrated lymph nodes. Worse CSS had patients with poorly differentiated tumor and lower OS, observed in cases who not received chemotherapy, aged ≥ 65 years, stage IIIC AJCC and with right colon cancer. Overexpression of BAD and Ki-67 in IF and PUMA in the TC associated with poor patients’ prognosis. In multivariate analysis as independent unfavorable prognostic indicators for DFS and CSS highlighted the lymphovascular invasion, ≥4 infiltrated lymph nodes and Ki-67 overexpression. Independent adverse predictor for DFS was the overexpression of BAD. For OS emerged as independent adverse prognostic indicators ≥4 metastatic lymph nodes, the location of tumor in rectum and right colon, no chemotherapy treatment and high-expression of p53, Mdm2 and Ki-67. As independent unfavorable prognostic value was highlighted the combination of over-expression of PUMA with low expression of p53 in both OS and CSS.CONCLUSIONS: Significant differences was found in expression of markers between tumor and normal tissue. Significant associations were observed among markers expression and clinicopathological features. In DFS, the high-expression of BAD, and Ki-67, the presence of lymph node metastasis and lymphovascular invasion emerged independent adverse prognostic markers. As independent favorable prognostic indicators for OS were highlighted the lack of lymph node metastasis, the location in the left colon, chemotherapy treatment and low-expression of p53 and Mdm2. The combined high expression of PUMA with low expression of p53, as well as high Ki-67, were independent unfavorable prognostic indicators for both the OS and CSS. Further studies in larger patient cohort are needed to clarify the prognostic role of these markers and to validate the results of our study.

ΣΚΟΠΟΣ: Η ανοσοϊστοχημική (ΑΙΧ) διερεύνηση, σε ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ κατά ΤΝΜ, μιας σειράς πρωτεϊνών που λαμβάνουν μέρος στην PUMA/p53 αποπτωτική οδό, η αξιολόγηση της σχέσης τους με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και η μελέτη της προγνωστικής τους αξίας.ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: 130 ασθενείς υποβλήθηκαν σε επέμβαση για χειρουργήσιμο αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ. Σε ιστούς από κύβους παραφίνης με τεμάχια όγκου, φυσιολογικού ιστού και μεταστατικού λεμφαδένα μελετήθηκαν με την χρήση ΑΙΧ οι πρωτεΐνες PUMA, p53, Ki-67, BAD, BID, Bcl2 και Mdm2. Οι ανοσοχρώσεις αξιολογήθηκαν με το HistoScore. Για τις συσχετίσεις χρησιμοποιήθηκαν κατά περίπτωση οι αντίστοιχες στατιστικές δοκιμασίες. Oι επιβιώσεις εκτιμήθηκαν με τις καμπύλες Kaplan-Meier, ενώ πραγματοποιήθηκε μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τους ασθενείς, 39 εμφάνισαν καρκίνο στο δεξιό κόλον, 52 στο αριστερό κόλον και 39 στο ορθό. Σε 88 χορηγήθηκε χημειοθεραπεία, ενώ σε 40 καμία. Ο διάμεσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 54 μήνες (εύρος: 1-81), η 3-ετής επιβίωση (CSS) ήταν 70.8%, ενώ η DFS 67%. Η πλειοψηφία των νεοπλασμάτων ήταν μέτριας διαφοροποίησης, 50% ήταν σταδίου C κατά Astler Coller, 30% είχαν λεμφαγγειακή διήθηση, ενώ 50% δεν εμφάνισε λεμφαδενικές μεταστάσεις. Θετικές συσχετίσεις αναδείχθηκαν μεταξύ των δεικτών ΒAD/ BID, PUMA/ ΒAD, PUMA/ Ki-67 και p53/Mdm2. Παρατηρήθηκε υπερέκφραση των πρωτεϊνών στον νεοπλασματικό σε σχέση με τον φυσιολογικό ιστό με εξαίρεση την Bcl-2 όπου παρατηρήθηκε το αντίθετο. Συσχετίσεις αναδείχθηκαν μεταξύ Bcl-2 και ιστολογικής διαφοροποίησης, BAD και εντόπισης του όγκου, p53 και αριθμού διηθημένων λεμφαδένων, BID/Mdm2 και μέγιστης διάμετρου όγκου και τέλος της Ki-67 με τα βλεννώδη αδενοκαρκινώματα. Στατιστικά σημαντικά μικρότερη επιβίωση (CSS), (DFS) και (OS) εμφάνισαν οι ασθενείς με λεμφαγγειακή διήθηση και με στάδιο Ν2. Επιπλέον, μικρότερη CSS είχαν οι ασθενείς με χαμηλή διαφοροποίηση του όγκου, ενώ σημαντικά μικρότερη OS, παρατηρήθηκε σε όσους δεν έλαβαν χημειοθεραπεία, σε ηλικίες ≥ 65 έτη, στους ασθενείς σταδίου ΙΙΙC καθώς και με εντόπιση στο δεξιό κόλον. Ως ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες τόσο για το DFS όσο και για το CSS αναδείχθηκαν η λεμφαγγειακή διήθηση, το στάδιο Ν2 και η υπερέκφραση του Ki-67. Επιπλέον για την DFS ανεξάρτητος δυσμενής προγνωστικός δείκτης αναδείχθηκε η υψηλή έκφραση της BAD. Για την ΟS, αναδείχθηκαν ως ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες το στάδιο Ν2, η εντόπιση στο ορθό και δεξιό κόλον, η μη λήψη χημειοθεραπείας και η υπερέκφραση των πρωτεϊνών p53, Mdm2 και Ki-67. Ανεξάρτητος δυσμενής προγνωστικός δείκτης αναδείχθηκε ο συνδυασμός της υπερέκφρασης της PUMA με υποέκφραση της p53 στην ΟS και στην CSS.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των δεικτών μεταξύ νεοπλασματικού και φυσιολογικού ιστού και σημαντικές συσχετίσεις των δεικτών με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η υπερέκφραση των BAD και Κi-67, η λεμφαδενική μετάσταση και η λεμφαγγειακή διήθηση αναδείχθηκαν ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες στην DFS. Ευνοϊκοί προγνωστικοί δείκτες για την ΟS αναδείχθηκαν η απουσία λεμφαδενικής μετάστασης, η εντόπιση στο αριστερό κόλον, η λήψη χημειοθεραπείας και η υποέκφραση των p53 και Mdm2. Ο συνδυασμός υπερέκφρασης της PUMA με υποέκφραση της p53 και η υπερέκφραση της Κi-67, αποτέλεσαν δυσμενείς προγνωστικούς δείκτες για την OS και την CSS.