Μελέτη των γονιδίων και των πρωτεϊνών TACI και ICOS σε ασθενείς με λεμφοπαραγωγά σύνδρομα

Abstract

Purpose: TACI and BAFFR might participate in the survival of CLL cells, protecting them from apoptosis through NF-κB. Mutations of TNFRSF13B, TNFRSF13C and ICOS genes have been associated with antibody deficiencies. The aim of this study was to detect the mutations of TNFRSF13B gene in Greek patients with antibody deficiencies and to determine the expression of TNFRSF13B/TACI, TNFRSF13C/BAFFR and ICOS on CLL cells and their contribution to the phenotype and the prognosis of the disease. Materials and methods: Samples from 53 patients with antibody deficiencies, 94 patients with CLL, 30 patients with NHL and 315 healthy individuals, were collected. The mRNA and protein levels of TNFRSF13B and TNFRSF13C were estimated by qRT-PCR and flow cytometry, respectively. BAFF and APRIL serum levels were estimated by ELISA. In CLL, the prognostic factors CD38 and the hypermutation status of IGHV gene were determined using flow cytometry and PCR-sequencing, respectively. CLL cells were stimulated by BAFF and APRIL and the apoptosis status was estimated by flow cytometry using an Annexin V-FITC/7-AAD (7-AAD) kit. The molecular analysis of TNFRSF13B gene was performed using PCR-sequencing and the detection of the polymorphisms TNFRSF13B-P251L, TNFRSF13B-V220A, TNFRSF13C-P21R and TNFRSF13C-H159Y using PCR-RFLP. Results: Μutations of TNFRSF13B gene are found both in patients and healthy individuals. CLL patients displayed signicantly lower expression of TACI (Median: 7,4%, IQR:2,1-20,8) compared to NHL patients (Median: 31,5, IQR: 9,6-61,8), p<0,001 and lower MFI of BAFFR compared to healthy controls (Median: 6,1 IQR:4,6-7,5 vs Median: 9,8 IQR:6,7-14,5 respectively). Serum BAFF was absent in the majority of CLL patients. Additionally, CLL cells with low or absent TACI expression were more susceptible to apoptosis in vitro after stimulation with all mitogens. TNFRSF13B/TACI expression and TNFRSF13C/BAFFR expression were not signicantly associated with the presence of autoimmunity, the infection risk and the prognosis of CLL. Conclusions: The mutations of TNFRSF13B are not causative factors for the apperance of antibody deficiencies. Τhe low TACI expression suggest that CLL may derive from CD5+ B cell populations rather than memory B cells and low BAFFR MFI could be used for the detection of minimal residual disease of CLL. These findings should be taken into account in the case of anti-TACI and anti-BAFFR therapeutic approaches.

Εισαγωγή: Οι υποδοχείς TNFRSF13B/TACI και TNFRSF13C/BAFFR ενεργοποιούν τον NF-κΒ στα νεοπλασματικά Β-κύτταρα προστατεύοντας τα πιθανόν από την απόπτωση. Μεταλλάξεις των γονιδίων TNFRSF13B, TNFRSF13C και ICOS, έχουν ενοχοποιηθεί στην παθογένεση των αντισωματικών ανεπαρκειών και στην εμφάνιση λεμφοϋπερπλασιών. Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη του TNFRSF13B σε ανοσοανεπαρκούντες ασθενείς και των TACI, BAFFR και ICOS σε ασθενείς με ΧΛΛ. Υλικό και Μέθοδοι: Συλλέχθηκαν δείγματα 53 ασθενών με αντισωματικές ανεπάρκειες, 94 με ΧΛΛ, 30 με NHL και 315 φυσιολογικών μαρτύρων. Η έκφραση TACI και BAFFR σε πρωτεϊνικό επίπεδο ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής ενώ σε μεταγραφικό επίπεδο με qRT-PCR. Στους ασθενείς με ΧΛΛ μελετήθηκαν προγνωστικοί δείκτες της νόσου, όπως η έκφραση CD38 με κυτταρομετρία ροής καθώς και οι υπερμεταλλάξεις της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών με PCR-sequencing. Στον ορό ασθενών με ΧΛΛ και φυσιολογικών μαρτύρων προσδιορίστηκαν τα BAFF και APRIL. Η λειτουργικότητα του TACI ελέγχθηκε μετά από καλλιέργεια των ΧΛΛ κυττάρων παρουσία BAFF και APRIL. Στους ασθενείς με αντισωματικές ανεπάρκειες έγινε PCR-sequencing του γονιδίου TNFRSF13B, ενώ στα δείγματα ασθενών με ΧΛΛ και φυσιολογικών μαρτύρων έγινε ανίχνευση των πολυμορφισμών TNFRSF13B- P251L, TNFRSF13B- V220A, TNFRSF13C- P21R και TNFRSF13C- Η159Υ. Αποτελέσματα: Γενετικές βλάβες του TNFSRF13B εμφανίζονται σε ανοσοανεπαρκούντες και σε φυσιολογικά άτομα. Τα Β-κύτταρα ΧΛΛ ασθενών εξέφραζαν BAFFR, αλλά με σημαντικά χαμηλότερη ένταση φθορισμού συγκριτικά με τα φυσιολογικά Β-κύτταρα (Median:6,1 IQR:4,6-7,5 vs Median:9,8 IQR:6,7-14,5), p<0,001. Η πλειονότητα των ασθενών με ΧΛΛ παρουσίαζε χαμηλή έκφραση TACI (Median:7,4%, IQR:2,1-20,8), σε σχέση με τους ασθενείς με NHL (Median:31,5, IQR: 9,6-61,8), p<0,001. Στον ορό των ασθενών τα επίπεδα BAFF ήταν χαμηλά και τα επίπεδα APRIL αυξημένα συγκριτικά με τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Δε διαπιστώθηκε συσχέτιση της έκφρασης TACI και BAFFR με την παρουσία αυτοάνοσων εκδηλώσεων, λοιμώξεων ή την πρόγνωση της ΧΛΛ.Συμπεράσματα: Οι μεταλλάξεις του γονιδίου TNFSRF13B δεν είναι αιτιολογικές για την εμφάνιση αντισωματικών ανεπαρκειών. Η χαμηλή έκφραση TACI ισχυροποιεί την υπόθεση προέλευσης του λευχαιμικού κυττάρου από τον Β1-υποπληθυσμό. Το πρότυπο έκφρασης του BAFFR από τα νεοπλασματικά Β-κύτταρα, το καθιστά χρήσιμο δείκτη για τον έλεγχο της υπολειπόμενης νόσου. Τα αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν υπόψιν στην περίπτωση αντι-TACI και αντι-BAFFR θεραπευτικών προσεγγίσεων.