Μεταλλάξεις TACI και ICOS: επιδημιολογία και κλινικές συσχετίσεις σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική νόσο

Abstract

OBJECTIVE COPD is a systemic disease whereas the participation of immune cells has been associated with the severity of the disease. The purpose of this study was to investigate in COPD patients the expression of the TACI and BAFFR receptors on B-cells, the presence of TNFRSF13B/TACI and ICOS variations, the phenotype of immune cells (and their subpopulations) in the peripheral blood at different stages of the disease, along with the levels of immunoglobulins. Additionally, regarding our previous results, concerning the role of TLRs in the onset of COPD, the study also included the detection of single nucleotide polymorphisms of TLR2 and TLR4, in conjunction with TNFRSF13B/TACI and ICOS variants, in order to determine whether co-segregating variations are involved in the pathogenesis or affect the phenotype of the disease. SAMPLES Peripheral blood was collected from 123 patients with COPD and 66 healthy controls (age- and sex-matched). For patients, blood sampling was repeated 6 and 12 months later (56 and 44 patients, respectively). For all the subjects immunophenotyping was performed directly after sampling, while genetic material and serum was also isolated. METHODS The expression levels of the TACI and BAFFR receptors, through monoclonal antibodies anti-CD267 (clone: 1a1, BioLegend) and anti-CD268 (clone: 11C1, BioLegend) respectively, and the immunophenotyping of peripheral blood cells were estimated by flow cytometry. The detection of V220A, P251L, C104R variants of TNFRSF13B/TACI, the D299G and T399I polymorphisms of TLR4, and R753Q of TLR2 was performed by PCR-RFLP protocol, while the detection of ICOS deletions by long-range PCR. The concentration of immunoglobins was determined by immunonephelometry. Statistical analyses were performed by the non-parametric Mann-Whitney and the Spearman correlation tests, using the SPSS (v13.0) software. RESULTS TACI receptor expression was found higher in COPD patients compared to healthy controls (mean±SD: 34.6 ± 20.2% and 26.7 ± 12.6%, respectively, p=0.019). Peripheral blood lymphocyte populations, including total lymphocytes, B-cells, and NK cells, were significantly decreased in COPD patients, while these reductions were proportional to the progression of the disease (p <0.05). Interestingly, the use of inhaled fluticasone resulted in a reduction of T-helper and B cells and simultaneously to an increase of the levels of IgG (p=0.001) and its subclasses IgG1 (p=0.022), IgG2 (p=0.035) and IgG3 (p=0.017) in the peripheral blood. Furthermore, the above findings, due to the usage of fluticasone, were also associated with an increased incidence of disease exacerbations (p=0.006). Finally, variants of TACI, TLR2 and TLR4 were observed both in COPD patients and healthy controls with a rather similar frequency (p>0.05). However, patients with mild and moderate form of the disease exhibited a greater segregation of genetic variants compared to patients with severe and very severe disease (p=0.038). CONCLUSION Patients with COPD displayed a significant increase of TACI expression on B-cells and also, significant decreases in the absolute numbers of subpopulations of immune cells, compared to healthy individuals. However, the reduction of T-helper and B cells, along with an increase of COPD exacerbations, was mainly attributed to the usage of inhaled fluticasone. Furthermore, in COPD the segregation of immune gene variants seems to favor a protective effect in patients with mild and moderate disease. These findings could represent determinants of disease outcome in patients with COPD.

ΣΚΟΠΟΣ Σύμφωνα με πρόσφατες βιβλιογραφικές εργασίες, η ΧΑΠ είναι μια συστηματική νόσος στην οποία η συμμετοχή κυττάρων του ανοσιακού συστήματος σχετίζεται με την σοβαρότητά της. Εντούτοις, η μελέτη του φαινομένου σε επίπεδο έκφρασης υποδοχέων της ειδικής ανοσίας και γονιδίων που τα εκφράζουν, καθώς και ο ανοσοφαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κυττάρων του περιφερικού αίματος συγκριτικά με αντίστοιχα φυσιολογικά άτομα, ιδίας ηλικίας και φύλου, δεν είχε μελετηθεί συστηματικά. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η έκφραση των υποδοχέων TACI και BAFFR στα Β-κύτταρα και η παρουσία γενετικών βλαβών-παραλλαγών στα γονίδια TACI και ICOS σε ασθενείς με ΧΑΠ και αντίστοιχους υγιείς μάρτυρες. Επίσης σκοπός ήταν να προσδιοριστεί ο φαινότυπος των κυττάρων του ανοσιακού συστήματος στο περιφερικό αίμα των ασθενών σε διάφορα στάδια της νόσου καθώς και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ανοσοσφαιρινών (πάντα συγκριτικά με ομάδα υγιών μαρτύρων). Επιπρόσθετα, λαμβάνοντας υπόψη την ύπαρξη προηγούμενων αποτελεσμάτων του εργαστηρίου, όσον αφορά το ρόλο των TLRs στην εμφάνιση της ΧΑΠ, η μελέτη συμπεριέλαβε και την ανίχνευση μονήρων νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών των TLR2 και TLR4, που μελετήθηκαν σε συνδυασμό με παραλλαγές των γονιδίων TNFRSF13B και ICOS, για να διαπιστωθεί αν συρρέοντες παραλλαγές ανοσογονιδίων συμμετέχουν στην παθογένεση ή επηρεάζουν το φαινότυπο της νόσου. ΥΛΙΚΟ Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα από 123 ασθενείς με ΧΑΠ και 66 υγιείς μάρτυρες κατά την ένταξή τους στη μελέτη. Για τους ασθενείς η αιμοληψία επαναλήφθηκε 6 και 12 μήνες μετά (56 και 44 ασθενείς, αντίστοιχα). Από όλα τα άτομα της μελέτης απομονώθηκε γενετικό υλικό και ορός. ΜΕΘΟΔΟΙ Η έκφραση των υποδοχέων TACI και BAFFR, μέσω των μονοκλωνικών αντισωμάτων αντι-CD267 (κλώνος: 1α1, BioLegend) και αντι-CD268 (κλώνος:11C1, BioLegend), καθώς και ο ανοσοφαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κυττάρων του περιφερικού αίματος πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η ανίχνευση των παραλλαγών V220A, P251L, C104R του γονιδίου TNFRSF13B/TACI, των πολυμορφισμών D299G και T399I του γονιδίου TLR4, και του R753Q του γονιδίου TLR2 έγινε με πρωτόκολλο PCR-RFLP. Η ανίχνευση ελλείψεων του γονιδίου ICOS έγινε με πρωτόκολλο PCR. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ανοσοσφαιρινών έγινε με ανοσονεφελομετρία. Η αναζήτηση συσχετίσεων έγινε με τη χρήση μονοπαραγοντικής λογιστικής παλινδρόμησης. Η σύγκριση των συνεχών μεταβλητών έγινε με μη παραμετρική δοκιμασία U των Mann-Whitney και τον συντελεστή συσχέτισης r κατά Spearman, με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος SPSS (v13.0). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο περιφερικό αίμα των ασθενών, κατά τη διάγνωση, διαπιστώθηκε υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα TACI στα Β-κύτταρα συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες (μέση τιμή±SD: 34,6±20,2% και 26,7±12,6%, αντίστοιχα, p=0,019). Παράλληλα, διαπιστώθηκε πως στο περιφερικό αίμα των ασθενών διάφοροι λεμφοκυτταρικοί πληθυσμοί εμφανίζονται ελαττωμένοι (λεμφοκύτταρα, Β-κύτταρα, ΝΚ-κύτταρα) και μάλιστα, η μείωση των κυττάρων ήταν ανάλογη με την πρόοδο της νόσου (p<0,05). Με βάση δευτερογενή ευρήματα της μελέτης φαίνεται ότι η χρήση της εισπνεόμενης φλουτικαζόνης οδηγεί σε μείωση των βοηθητικών Τ-κυττάρων και των Β-κυττάρων, καθώς και σε αύξηση της συγκέντρωσης της IgG (p=0,001) και των υποτάξεών IgG1 (p=0,022), IgG2 (p=0,035) και IgG3 (p=0,017). Παράλληλα, τα ευρήματα αυτά συνδυάστηκαν με αυξημένη συχνότητα παροξύνσεων της νόσου (p=0,006). Tέλος, παραλλαγές των TACI, TLR2 και TLR4 παρατηρούνται τόσο σε ασθενείς με ΧΑΠ όσο και σε υγιείς μάρτυρες με παρόμοια συχνότητα. Ωστόσο, αποκαλύφθηκε πως οι ασθενείς με ήπια και μέτρια μορφή της νόσου παρουσιάζουν μεγαλύτερη συσσώρευση γενετικών βλαβών συγκριτικά με τους ασθενείς με σοβαρή και πολύ σοβαρή νόσο (p=0,038). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Παρατηρήθηκε ότι, οι ασθενείς με ΧΑΠ, παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση του TACI υποδοχέα στα Β-κύτταρα και παράλληλα σημαντικές διαφορές στον απόλυτο αριθμό, κυρίως των Β-κυττάρων, με τα αντίστοιχα φυσιολογικά άτομα. Σε μια προσπάθεια διερεύνησης των ευρημάτων μας, διαπιστώθηκε ότι το φαινόμενο αυτό συνδέεται με την χρήση εισπνεόμενης φλουτικαζόνης. Παράλληλα, σε ασθενείς με σοβαρή έως πολύ σοβαρή νόσο παρατηρήθηκε μειωμένος αριθμός των παραλλαγών στα γονίδια που μελετήθηκαν. Η συσχέτιση αυτή δείχνει να συνηγορεί υπέρ της προστατευτικής επίδρασης της συρροής γενετικών παραλλαγών σε ασθενείς με ήπια και μέτρια νόσο. Τα χαρακτηριστικά αυτά (αριθμός κυττάρων και παρουσία παραλλαγών), θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν καθοριστικούς παράγοντες για την έκβαση της νόσου ασθενών με ΧΑΠ.