Έλεγχος προβιοτικών ιδιοτήτων σε στελέχη της ανθρώπινης εντερικής μικροχλωρίδας

Abstract

Introduction: The intestinal flora often referred to as a separate or independent body hosted within the intestinal tract (gut). It consists of different cell types but have the ability to communicate among themselves and with the host. They have the ability to consume, store and convert the energy involved in chemical pathways and can regenerate themselves. The genome contains more than 100 times more genes from human, endowing with capabilities and features, for which there was no need to develop the human genome.The intestinal microflora is thought to act to benefit the health of the individual, but is neither static nor detached from the environment. Several bacteria of the intestinal microflora have been found to carry genes resistant to antibiotics, without the person being sick or having received antibiotic. It seems that intestinal bacteria exchange genes among themselves and with germs that pass through the colon. The existence of microbes resistant to antibiotics is a potential threat to health, since many such microbes have been implicated in postoperative infections.In this study the intestinal microflora of healthy full term infants was studied and further more, the probiotic properties of Lactobacillus strains were investigated. The term " probiotic " is used to describe the microbial strains, which may be hosted in the human gut microflora and help to improve the health of the host. A bacterial strain to be considered as a probiotic must have good technological properties that can be used in food without losing the functionality of or generates unpleasant odor or taste. It survives as it passes from the upper gastrointestinal tract and reaches the site of action alive. It still retains its capacity to function in the intestinal environment. Also it should exhibit resistance to acids, bile salts, adhere to the intestinal epithelium and have long survival in the intestinal tract to induce immunostimulation and have antagonistic activity against pathogenic bacteria.Methods: In the present work the intestinal microflora of 62 healthy neonates was studied. Feacal samples were collected at 4, 30 and 90 days after delivevry. Total aerobes and anaerobes as well as lactobacilli, streptococci and bifidobacteria were enumerated. Enterococcus spp., Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. strains were isolated and identified using classical and molecular techniques.These strains were tested for their susceptibility to antibiotics, using the disc diffusion method. The isolated entrococci were further tested for the presence of tetracycline resistance genes [tet(K), tet(L), tet(M), tet(O), tet(S)], erythromycin (ermB) and vancomycin (vanA, vanV, vanC1 and vanC2/C3). Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. isolates were screened for their potential probiotic properties: ability to grow in the presence of bile salts, resistance to acid pH, adherence to Caco-2 colonic epithelial cells, antimicrobial activity, growth in prebiotic substrates The results of the incubation of the potential probiotic strains with Caco-2 epithelial cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was studied regarding the viability and the metabolic activity of Caco2 and PBMC, the production of reactive oxygen species as NO2-, H2O2 and finally, the potential immunostimulation they may exert to peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Results: There were no differences on the population levels of total aerobes, streptococci, enterococci, lactobacilli and bifidobacteria the first three months of life, while total anaerobes were significantly higher at the 90th day compared to the first (4 days) (p=0,012). 121 Gram-positive cocci were isolated. The species that prevailed is the E. faecalis (54,5%), followed by E. faecium, E. casseliflavus / E. flavescens, E. gallinarum and E. hirae. 71 strains of lactobacilli were isolated and 44 of them were identified. as: L. gasseri (19 strains), L. paracasei (7 strains), L. crispatus (5 strains), L.oris (3 strains), L. salivarius (3 strains), L. rhamnosus (2 strains), L. plantarum (1 strain), L. brevis (1 strain), L. fermentum (2 strain), L. reuteri (1 strain). Of the 26 strains of Bifidobacterium spp. only 6 were identified as B. lonqum (4 strains) and B. bifidum (2 strains).The strains of enterococci and streptococci were tested for their susceptibility to twelve antimicrobial agents. The highest prevalence of resistance was detected to rifampicin (46.28%), to tetracycline (44,63%) and to erythromycin (36,36%). PCR data revealed two strains of E. gallinarum carrying vanC1 gene and 11 strains of E. casseliflavus / flavescens carrying vanC2/C3. The ermB gene was detected in 25 strains, while 19 strains were also positive for the presence of tet genes.All strains of lactobacilli were sensitive to ampicillin, amoxicillin / clavulanic acid, tetracycline, erythromycin, cephalothin, chloramphenicol and rifampicin. The susceptibility to bacitracin, vancomycin, amikacin, kanamycin and ciprofloxacin was strain dependend. One strain of the genus Bifidobacterium was resistant to tetracycline.The screening for probiotic properties revealed two Lactobacillus isolates as potential probiotics: L. salivarius-C3 and L. rhamnosus-C44. The C3 strain could grow in fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS), while the C44 only in GOS. The C3 showed increase of total fatty acids after fructooligosaccharides and galactooligosaccharide (GOS) fermentation. The strain C44 presented significant increase in total fatty acids in all the different carbon sources used, except FOS.The mitochondrial activity of Caco-2 cells after co-incubation with the potential probiotic strain was measured by the MTT method. Only the thermally inactivated strain L.rhamnosus C44HI caused a significant increase in the mitochondrial activity of Caco-2 epithelial cells. The production of NO2- by the Caco-2 is not altered by any of the two candidate probiotic strains. The level of H2O2 produced after intervention with strain C3 and C3HI was significantly higher than control (p=0,002 and p=0,000 respectively) and it was also higher than the one produced from C44HI (p=0,004). The viability of PBMC was determined with Trypan blue stain. Neither of the candidate probiotic strains caused toxicity in peripheral blood polymorphonuclear cells. The production of NO2- from PBMC is markedly increased after co-incubation with the inactivated form of both lactobacilli C3HI (p=0,001) and C44HI (p=0,000). The C3 and C44 were found to induce the production of higher amount of H2O2 compared to the control (p-values 0,011, 0,060, respectively). The production of TNFa and IL-6 by PBMC was higher after incubation with strain C44 and its inactivated form (C44HI) compared to C3 incubation, but without to be able to verify statistically these results.Conclusions: This study detected high levels of total aerobic and anaerobic microflora. Over 50 % of newborns had enterococci from the 4th day and the proportion exceeded 80% at day 30 and remained almost to the same levels at day 90. The levels of lactobacilli did not change the first three months and they are not affected by the mode of delivery. The bifidobacteria were mainly B. longum and to a lesser extent B. bifidum and were isolated from neonates born by vaginal delivery. Half of enterococci (50.4%) exhibit resistance to many antimicrobial agents. The resistance to vancomycin was intrinsic, while 19 out of the 53 strains that were resistant to tetracycline carried resistant tet genes. The ermB gene was detected in 25 of the 44 strains that showed resistance to erythromycin. The resistance of lactobacilli in various antibiotics is often characterized as intrinsic. Indeed, the antibiotic resistance of certain probiotic strains may be an asset, since they could be administered with antibiotics and not be affected. Bacteria of the genus Bifidobacterium show no resistance to particular antibiotics. Of all the tested lactobacilli for probiotic properties finally two strains were distinguised, the L. salivarius-C3 and L. rhamnosus-C44. These strains don’t have the ability to use as a carbon source inulin and oligofructose, but they prefer fructo- and galacto- oligosaccharides.The influence of the presence of candidate probiotic strains L. salivarius-C3 and L. rhamnosus-C44 (live and heat inactivated) in the metabolic activity of intestinal epithelial cells Caco-2, and also to the viability of PBMC seems that is not subject to a rule but instead is dependent on each strain. The capacity of the probiotic bacteria to induce the production of nitrite and hydrogen peroxide has a protective role in the host, since they kill intracellular pathogens, tumor cells and cells infected by viruses. In this study there were differences depending on the cell type (Caco-2 cells or PBMC), on the probiotic strain and the presence of live or heat- inactivated bacilli. Additionally, it appears that they induce the production of cytokines.

Εισαγωγή: Η εντερική χλωρίδα συχνά αναφέρεται ως ένα ξεχωριστό ή ανεξάρτητο όργανο που φιλοξενείται μέσα τον εντερικό σωλήνα (το έντερο). Αποτελείται από διαφορετικά είδη κυττάρων που έχουν όμως την ικανότητα να επικοινωνούν μεταξύ τους αλλά και με τον ξενιστή. Έχουν την ικανότητα να καταναλώνουν, να αποθηκεύουν και να μετατρέπουν την ενέργεια, μεσολαβούν σε χημικά μονοπάτια και μπορούν να αναγεννηθούν από μόνα τους. Το γονιδίωμά τους περιέχει πάνω από 100 φορές περισσότερα γονίδια από το ανθρώπινο, προικίζοντας με δυνατότητες και χαρακτηριστικά, για τα οποία δεν χρειάστηκε να εξελιχθεί το ανθρώπινο γονιδίωμα. Η εντερική μικροχλωρίδα θεωρείται ότι δρα προς όφελος της υγείας του ατόμου, αλλά δεν είναι ούτε στατική, αλλά ούτε και αποκομμένη από το περιβάλλον. Αρκετά μικρόβια της εντερικής μικροχλωρίδας έχουν βρεθεί να φέρουν ανθεκτικά γονίδια στα αντιβιοτικά, χωρίς το άτομο να έχει νοσήσει ή να έχει λάβει αντιβιοτικό. Φαίνεται ότι εντερικά μικρόβια ανταλλάσουν γονίδια τόσο μεταξύ τους, όσο και με μικρόβια που περνούν από το παχύ έντερο. Η ύπαρξη μικροβίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά είναι πιθανή απειλή για την υγεία, αφού πολλά τέτοια μικρόβια έχουν εμπλακεί σε μετεγχειρητικές μολύνσεις.Στην παρούσα μελέτη εκτός από την εντερική μικροχλωρίδα των νεογνών μελετήθηκαν επιπλέον και οι προβιοτικές ιδιότητες στελεχών λακτοβακίλλων. O όρος «προβιοτικά» χρησιμοποιείται για να περιγράψει τα μικροβιακά στελέχη, τα οποία ενδέχεται να φιλοξενούνται στην εντερική μικροχλωρίδα του ανθρώπου και τα οποία βοηθούν στη βελτίωση της υγείας του ξενιστή. Ένα βακτηριακό στέλεχος για να θεωρηθεί προβιοτικό πρέπει να έχει καλές τεχνολογικές ιδιότητες ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε τρόφιμα χωρίς να χάνει την λειτουργικότητα του ή να δημιουργεί δυσάρεστες οσμές ή γεύση. Πρέπει να επιβιώνει καθώς περνά από το ανώτερο γαστρεντερικό σύστημα και να φτάνει ζωντανό στο σημείο δράσης. Πρέπει ακόμη να διατηρεί την ιδιότητά του να λειτουργεί στο εντερικό περιβάλλον. Θα πρέπει να επιδεικνύει αντοχή στα οξέα, στα χολικά άλατα, να προσκολλάται στο εντερικό επιθήλιο και να έχει μακρά επιβίωση στον εντερικό σωλήνα, να επάγει την ανοσοδιέγερση και να έχει ανταγωνιστική δράση εναντίον παθογόνων βακτηρίων.Μεθοδολογία: Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η εντερική χλωρίδα 62 νεογνών. Πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία κοπράνων την 4η, την 30η και την 90η ημέρα μετά τη γέννηση. Στη συνέχεια έγινε καταμέτρηση της ολικής αερόβιας και αναερόβιας χλωρίδας, όπως και καταμέτρηση και απομόνωση στελεχών εντεροκόκκων, λακτοβακίλλων και βακτηρίων του γένους Bifidobacterium. Ακολούθησε μοριακή ταυτοποίηση όλων των στελεχών των εντεροκόκκων και των βακτηρίων του γένους Bifidobacterium, ενώ για τους λακτοβακίλλους έγινε επιλογή. Τα στελέχη εξετάστηκαν ως προς την ευαισθησία τους στα αντιβιοτικά. Στη συνέχεια τα στελέχη εντεροκόκκων εξετάστηκαν ως προς την παρουσία γονιδίων ανθεκτικότητας στη τετρακυκλίνη [tet(K), tet(L), tet(M), tet(O), tet(S)], την ερυθρομυκίνη (ermB) και τη βανκομυκίνη (vanΑ, vanΒ, vanC1 και vanC2/C3). Τα στελέχη λακτοβακίλλων και τα βακτήρια του γένους Bifidobacterium εξετάστηκαν ως προς την πιθανή προβιοτική τους δράση: ικανότητα ανάπτυξης παρουσία χολικών αλάτων, την αντοχή τους σε χαμηλό pH, την ικανότητα προσκόλλησης τους σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου, την αντιμικροβιακή τους δράση, την δυνατότητα ανάπτυξής τους σε πρεβιοτικές ενώσεις και προσδιορίστηκαν τα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου που παράγουν. Εξετάστηκε επίσης η βιωσιμότητα και η μεταβολική δραστηριότητα των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου (Caco-2) και των περιφερειακών μονοπύρηνων κυττάρων (PBMC) μετά την επίδραση των υποψήφιων προβιοτικών στελεχών, η πιθανή παραγωγή ΝΟ2-, Η2Ο2 από τα ευκαρυωτικά κύτταρα και τέλος, ελέγχθηκε η ανοσοδιέγερση που προκαλούν στα περιφερειακά μονοπύρηνα κύτταρα (παραγωγή κυτταροκινών TNF-α, IL-6, IL-8 και adiponectin). Αποτελέσματα: Κατά τη μελέτη της εντερικής μικροχλωρίδας των νεογνών κατά τις τρεις δειγματοληψίες φαίνεται ότι δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των ολικών μεσόφιλων αερόβιων μικροοργανισμών κατά τους τρεις πρώτους μήνες της ζωής των νεογνών, ενώ υπάρχει σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των ολικών μεσόφιλων αναερόβιων μικροοργανισμών κατά τη σύγκριση της μέσης τιμής της 1ης δειγματοληψίας με τη 3η με p=0,012. Επίσης δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην μέση τιμή των εντεροκόκκων, των λακτοβακίλλων και των μικροβίων του γένους Bifidobacterium. Απομονώθηκαν 121 Gram θετικοί κόκκοι. Το είδος που υπερίσχυσε είναι το E. faecalis (54,5%) και ακολουθούν οι E. faecium, E. casseliflavus/ E. flavescens, E. gallinarum και E. hirae. Απομονώθηκαν συνολικά 71 στελέχη λακτοβακίλλων, ενώ ταυτοποιήθηκαν τα 44. Ομαδοποιημένα τα αποτελέσματα είναι: L. gasseri (19 στελέχη), L. paracasei (7 στελέχη), L. crispatus (5 στελέχη), L.oris (3 στελέχη), L. salivarius (3 στελέχη), L. rhamnosus (2 στελέχη), L. plantarum (1 στέλεχος), L. brevis (1 στέλεχος), L. fermentum (2 στελέχη), L. reuteri (1 στέλεχος). Από τα 26 στελέχη Bifidobacterium μόνο τα 6 ταυτοποιήθηκαν μοριακά. Τα τέσσερα ταυτοποιήθηκαν ως B. lonqum και δύο ως B. bifidum.Τα στελέχη εντερόκοκκων και στρεπτόκοκκων εξετάστηκαν ως προς την ευαισθησία που παρουσιάζουν σε δώδεκα αντιμικροβιακούς παράγοντες. Η μεγαλύτερη αναλογία (46,28%) ανθεκτικών στελεχών εμφανίζεται στη rifampicin. Ακολουθεί η tetracycline (44,63%) η erythromycin (36,36%). Σε 13 στελέχη εντοπίστηκαν γονίδια ανθεκτικότητας και πιο συγκεκριμένα βρέθηκαν 2 στελέχη E. gallinarum με το γονίδιο vanC1 και 11 στελέχη E. casseliflavus/ flavescens με το γονίδιο vanC2/C3. Το γονίδιο ermB εντοπίστηκε σε 25 στελέχη, ενώ 19 στελέχη ήταν θετικά για την παρουσία κάποιου από αυτά τα γονίδια tet.Όλα τα στελέχη λακτοβακίλλων ήταν ευαίσθητα στα ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, tetracycline, erythromycin, cephalothin, chloramphenicol και rifampicin. Στα υπόλοιπα αντιβιοτικά (bacitracin, vancomycin, amikacin, kanamycin και ciprofloxacin) η ευαισθησία εξαρτιόταν από το στέλεχος. Ένα στέλεχος του γένους Bifidobacterium ήταν ανθεκτικό στη τετρακυκλίνη.Είκοσι στελέχη λακτοβακίλλων επιδεικνύουν σημαντική αντοχή στη παρουσία χολικών αλάτων και 4 από τα 5 Bifidobacterium. Ως προς την ικανότητα προσκόλλησης στα Caco-2 ξεχώρισαν ο L. Salivarius-C3 και ο L. Rhamnosus-C44. Το C3 εμφανίζει μεγαλύτερη ανάπτυξη στον φρουκτοολιγοσακχαρίτη (Actilight®), στο γαλακτοολιγοσακχαρίτη (GOS) και στη γλυκόζη, ενώ το C44 μόνο στο GOS και στη γλυκόζη. Το C3 εμφάνισε αύξηση των ολικών λιπαρών οξέων μετά από την επώασή του στο υπόστρωμα με το φρουκτοολιγοσακχαρίτη και το γαλακτοολιγοσακχαρίτη (GOS). Το στέλεχος C44 εμφάνισε αύξηση στα ολικά λιπαρά οξέα σε όλες τις διαφορετικές πηγές άνθρακα, εκτός από το Actilight στο οποίο όμως έχει την τάση να εμφανίσει. Η μιτοχονδριακή δραστηριότητα των Caco-2 κυττάρων μετά από την συν-επώασή τους με το υπό εξέταση προβιοτικό στέλεχος μετρήθηκε με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Μόνο το απενεργοποιημένο θερμικά στέλεχος L.rhamnosus C44HI προκάλεσε σημαντική αύξηση στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα των Caco-2 επιθηλιακών κυττάρων. Η παραγωγή του NO2- από τα Caco-2 δεν μεταβάλλεται από κανένα από τα δύο υποψήφια προβιοτικά στελέχη. Το επίπεδο του H2O2 μετά από την παρέμβαση με το στέλεχος C3 καθώς και με το C3HI ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από τον μάρτυρα (p-value=0,002 και p-value=0,000 αντίστοιχα), όπως επίσης και από τους απενεργοποιημένους λακτοβακίλλους του C44ΗΙ (p-value=0,004). Η βιωσιμότητα των PBMC καθορίστηκε με καταμέτρηση τους μετά από χρώση με Trypan blue. Κανένα από τα δύο εξεταζόμενα υποψήφια προβιοτικά στελέχη δεν προκάλεσε τοξικότητα στα περιφερειακά πολυμορφοπύρηνα κύτταρα του αίματος. Η παραγωγή του NO2- από τα PBMC είναι σημαντικά αυξημένη μετά από την συν-επώαση με τις δύο απενεργοποιημένες μορφές των δύο λακτοβακίλλων C3HI (p= 0,001) και C44HI (p= 0,000). Τα C3 και C44 βρέθηκε να επάγουν μεγαλύτερη ποσότητα H2O2 από τα ίδια κύτταρα σε σχέση με τον μάρτυρα (p-values 0,011, 0,060 αντίστοιχα). Η παραγωγή του TNFa και της IL-6 από τα PBMC είναι μεγαλύτερη μετά από την επώαση με το στέλεχος C44 και την απενεργοποιημένη μορφή του (C44ΗΙ) από το C3, χωρίς όμως να μπορούν τα αποτελέσματα αυτά να ελεγχθούν στατιστικά.Συμπεράσματα: Στη παρούσα μελέτη ανιχνεύτηκαν υψηλά επίπεδα ολικής αερόβιας και αναερόβιας μικροχλωρίδας. Πάνω από 50% των νεογνών είχε εντερόκοκκους την 4η ημέρα και το ποσοστό ξεπέρασε το 80% την 30η ημέρα και παρέμεινε σχεδόν στα ίδια επίπεδα την 90η ημέρα. Τα επίπεδα των λακτοβακίλλων δεν μεταβάλλονται με τη πάροδο της δειγματοληψίας και δεν επηρεάζονται από τον τρόπο γέννησης. Τα μπιφιδοβακτήρια που απομονώθηκαν είναι κυρίως B. longum και σε μικρότερο βαθμό B. bifidum και φαίνεται να προέρχονται κυρίως από νεογνά που γεννήθηκαν με φυσιολογικό τοκετό.Το 50,4% των εντερόκοκκων εμφανίζουν πολυανθεκτικότητα. Η ανθεκτικότητα στη βανκομυκίνη ήταν ενδογενής, ενώ τα 19 από τα 53 στελέχη, που ήταν ανθεκτικά στη τετρακυκλίνη, φέρουν γονίδια ανθεκτικότητας tet. Το ermB γονίδιο εντοπίστηκε στα 25 στελέχη από τα 44 που εμφάνισαν ανθεκτικότητα στην ερυθρομυκίνη. Η ανθεκτικότητα των λακτοβακίλλων σε διάφορα αντιβιοτικά συνδέεται αρκετές φορές με ενδογενή ανθεκτικότητα. Μάλιστα η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά ορισμένων προβιοτικών στελεχών μπορεί να θεωρηθεί επιπλέον προσόν, αφού θα μπορούν να χορηγηθούν μαζί με αντιβιοτικά και να μην επηρεαστεί η βιωσιμότητα τους. Τα βακτήρια του γένους Bifidobacterium δεν εμφάνισαν ιδιαίτερη ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά.Από όλους τους λακτοβακίλλους που εξετάστηκαν για τις προβιοτικές τους ιδιότητες ξεχώρισαν τελικά δύο στελέχη, ο L. salivarius-C3 και ο L. rhamnosus-C44. Τα στελέχη αυτά δεν έχουν την ικανότητα να χρησιμοποιήσουν ως πηγή άνθρακα την ινουλίνη και την ολιγοφρουκτόζη, αλλά προτιμούν τους φρουκτο- και γαλακτο-ολιγοσακχαρίτες.Η επίδραση της παρουσίας των υποψηφίων προβιοτικών στελεχών L. salivarius-C3 και L. rhamnosus-C44 (ζωντανών και θερμικά απενεργοποιημένων) στη μεταβολική δραστηριότητα των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου Caco-2, αλλά και στη βιωσιμότητα των PBMC φαίνεται ότι δεν υπόκειται σε κάποιον κανόνα, αλλά αντίθετα είναι εξαρτώμενη από το κάθε στέλεχος. Η ιδιότητα των προβιοτικών βακτηρίων να επάγουν την παραγωγή νιτρωδών και υπεροξειδίου του υδρογόνου έχει προστατευτικό ρόλο στον ξενιστή, αφού θανατώνουν ενδοκυτταρικά παθογόνα, καρκινικά κύτταρα και κύτταρα προσβεβλημένα από ιούς. Στη παρούσα μελέτη υπήρχαν διαφορές ανάλογα με τον τύπο των κύτταρων, του στελέχους και την ύπαρξη ζωντανών ή θερμικά απενεργοποιημένων παραγόντων. Επιπρόσθετα, φαίνεται ότι τα στελέχη επάγουν την παραγωγή κυτταροκινών.