Μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός ζυμών με πιθανές προβιοτικές ιδιότητες και προσδιορισμός της ανοσοτροποποιητικής τους δράσης in vivo

Abstract

Probiotics are living microorganisms that when ingested in adequate numbers exert health benefits to the host. The most common probiotics belong to the genera Lactobacillus and Bifiobacterium. Despite the occurrence of yeasts as an integral part of many dairy products their potential as probiotics has begun to develop only in the recent years. Although in vitro probiotic tests allow the selection of the desired microorganisms among a large number of microorganisms, they cannot simulate the complex environment and interactions that characterize an in vivo system. In order for a microorganism to be characterized as probiotic, in vivo studies on guinea pigs as well as human clinical trials are required. Due to the fact that the beneficial (probiotic) properties are strain-specific and on the basis of polyphasic taxonomy, in the present study we used biochemical and molecular methods for the confirmation of the identification of yeast strains isolated from Feta cheese and infants’ gastrointestinal tract (faeces). The identification data according to the metabolic (Biolog YT) and chromosome (PFGE) profiles showed that PFGE in combination with a sensitive biochemical method such as Biolg YT could be used for the reliable identification of yeast strains. The presence of yeast plasmid DNA as well as several biochemical characteristics for the safety assessment of yeasts was also determined. Only two strains (KK3.1, KK4.1) of the species C. albicans were excluded due to their potential pathogenicity. Then, the yeast strains (13 out of 14 strains) with in vitro probiotic characteristics were selected after in vitro determination of their probiotic properties. Because of the large number of strains with in vitro probiotic properties, it was impracticable (time-consuming and expensive) to study the in vivo immunoenhancing-immunomodulatory activity of all these strains. So, we examined whether the dorsal air pouch model could be used as an alternative system for the selection of strains with immunomodulatory activity. The selection of the air pouch system was based on the observation that both the intestinal mucosa and the air pouch function as barriers which are formed by epithelial cells and macrophages. Determination of several immune parameters (number of polymorphonuclear cells, phagocytic activity, cytokine profile) in the mouse and rat air pouch showed that only four strains (S. cerevisiae 982, S. boulardii ΚΚ1 και K. lactis 570, 630) have the biggest potential to be characterized as probiotics. Besides in vitro biochemical and microbiological probiotic properties, these strains also possess in vivo immunoenhancing-immunomodulatory activity in the air pouch, which is affected by their growth temperature. In order to further study their immunomodulatory activity in the intestinal mucosa, the natural habitat of probiotics, and to validate the use of the air pouch as an in vivo model for the selection of probiotic strains with 123 immunomodulatory activity the selected yeast strains were orally administered into mice. Their oral administration resulted in increased production of IgA antibodies without inducing an inflammatory response and a strain-specific cytokine profile. Moreover, the strains induced the simultaneous strain-specific expression of several TLRs, which would probably favor the differential activation of the immune mechanisms. The results of this doctoral thesis show that the dorsal air pouch model can be used as a reliable and fast model for the selection of probiotic yeast strains with immunomodulatory activity in the intestinal mucosa. Under normal conditions, the activation of the innate mechanisms by potential probiotic yeast strains through a strict regulation of TLR expression and antibody and cytokine production could have beneficial effects in the development, in the homeostasis as well as in the enhancement of the defense mechanisms of the immune system. In addition, the selected yeast strains could be used as gene delivery and expression systems for therapeutic or vaccination purposes as well as probiotics with the ability to decrease cholesterol levels

Ως προβιοτικά χαρακτηρίζονται οι ζωντανοί μικροοργανισμοί που όταν καταναλωθούν σε κατάλληλες ποσότητες ασκούν ευεργετική δράση στον ξενιστή. Οι κυριότεροι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικοί περιλαμβάνουν βακτήρια του γένους Lactobacillus και Bifidobacterium. Παρόλο που οι ζύμες αποτελούν μέρος της μικροχλωρίδας πολλών γαλακτοκομικών προϊόντων το ενδιαφέρον για τη χρήση τους ως προβιοτικά άρχισε να αναπτύσσεται μόλις τα τελευταία χρόνια. Αν και οι in vitro δοκιμές για τον έλεγχο των προβιοτικών ιδιοτήτων επιτρέπουν την επιλογή των επιθυμητών στελεχών μέσα από μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών, εντούτοις δεν μπορούν να προσομοιάσουν τις πολύπλοκες συνθήκες και αλληλεπιδράσεις που χαρακτηρίζουν ένα in vivo σύστημα. Ο τελικός χαρακτηρισμός ενός στελέχους ως προβιοτικό απαιτεί χρονοβόρα in vivo πειράματα σε πειραματόζωα αλλά και κλινικές δοκιμές στον άνθρωπο. Καθώς οι ευεργετικές (προβιοτικές) ιδιότητες των μικροοργανισμών διαφέρουν ακόμα και ανάμεσα σε στελέχη του ίδιου είδους (στελεχο-ειδικές) στο πλαίσιο της πολυφασικής ταξινόμησης έγινε στην παρούσα εργασία η επιβεβαίωση της ταυτοποίησης των στελεχών ζυμών που απομονώθηκαν από τυρί φέτα και το γαστρεντερικό σωλήνα (κόπρανα) βρεφών με βιοχημικές και μοριακές μεθόδους. Η ταυτοποίηση με βάση το μεταβολικό (Biolog YT) και χρωμοσωμικό (PFGE) πρότυπο έδειξε ότι η PFGE σε συνδυασμό με μία ευαίσθητη βιοχημική μέθοδο όπως το Biolog YT επιτρέπουν την αξιόπιστη ταυτοποίηση των στελεχών ζυμών. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν η πιθανή ύπαρξη πλασμιδίου καθώς και διάφορα βιοχημικά χαρακτηριστικά για τον έλεγχο της ασφάλειας των ζυμών, όπου δύο στελέχη (ΚΚ3.1, ΚΚ4.1) του είδους C. albicans αποκλείστηκαν από τα επόμενα πειράματα ως δυνητικά παθογόνα. Ακολούθησε ο προσδιορισμός και η επιλογή των στελεχών (13 από τα 14 στελέχη) που διαθέτουν in vitro προβιοτικές ιδιότητες. Ο μεγάλος αριθμός στελεχών που διέθεταν in vitro προβιοτικές ιδιότητες καθιστούσε αδύνατο (χρονικά και οικονομικά) να γίνει έλεγχος της in vivo ανοσοενισχυτικής–ανοσοτροποποιητικής δράσης όλων αυτών των στελεχών. Έτσι, έγινε διερεύνηση κατά πόσο το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα εναλλακτικό σύστημα για ένα γρήγορο αρχικό διαχωρισμό και την επιλογή στελεχών με ανοσοτροποποιητική δράση. Η επιλογή του μοντέλου του ραχιαίου αεροθύλακα έγινε με βάση την παρατήρηση ότι τόσο ο εντερικός βλεννογόνος όσο και ο αεροθύλακας λειτουργούν ως μηχανικοί φραγμοί μέσω δομών που σχηματίζονται από επιθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα. Ο προσδιορισμός διαφόρων τοπικών ανοσοβιολογικών παραμέτρων (αριθμός πολυμορφοπύρηνων κυττάρων, φαγοκυτταρική ικανότητα, πρότυπο κυτοκινών) στον αεροθύλακα επίμυων και ποντικών έδειξε ότι μόνο 4 στελέχη (S. cerevisiae 982, S. 121 boulardii ΚΚ1 και K. lactis 570, 630) παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη πιθανότητα να έχουν προβιοτική δράση. Τα στελέχη αυτά βρέθηκε ότι εκτός από in vitro βιοχημικές και μικροβιολογικές προβιοτικές ιδιότητες διαθέτουν και in vivo ανοσοενισχυτική- ανοσοτροποποιητική δράση στον αεροθύλακα, η οποία επηρεάζεται και από τη θερμοκρασία ανάπτυξής τους. Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η ανοσοτροποποιητική τους δράση στον εντερικό βλεννογόνο, το φυσικό ενδιαίτημα των προβιοτικών, και να ενισχυθεί η χρήση του μοντέλου του ραχιαίου αεροθύλακα ως ένα in vivo μοντέλο επιλογής προβιοτικών στελεχών με ανοσοτροποποιητική δράση έγινε στοματική χορήγηση των επιλεγμένων στελεχών ζυμών σε ποντίκια.