Μελέτη φαινολικών ενώσεων φυτικής προέλευσης με χρήση φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και συνδυαστικών τεχνικών

Abstract

The main objectives of this PhD thesis was the development and implementation ofmethodologies of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in the identification ofcompounds in complex plant extracts without any previous chromatographic separation andisolation of the individual components. The main conclusions and methodologies of thepresent PhD thesis are as follows:(a) A simple method for NMR observation of –OH groups in the solvent DMSO-d6was developed based on the combined use of picric acid, dilute solutions and temperaturesnear the freezing point of the solution. This results in a significant reduction in the exchangerate of protons and, thus, in the line widths of the individual phenol –OH groups. Theimplementation of two-dimensional 1H-13C NMR resulted in the complete identification ofnatural antioxidants in extracts of natural products without the use of complex and timeconsuming chromatographic techniques for isolation of each individual component.(b) The great sensitivity of %(1H) of –OH groups to changes of the electronicenvironment in combination with increased resolution of the –OH groups is an excellentmethod to achieve the complete identification of e.g. flavonoids, although several carbonshave similar or identical chemical shifts.(c) The present research results provide important information about the potentialitiesto classify the absorptions of the –OH groups on the basis of the structure of the molecule andthe nature of the substituens in the rings. This demonstrates also the important diagnostic roleof the –OH groups which may have in the analysis of complex plant extracts, without priorchromatographic separation of the individual components. A key advantage of using theabsorptions of the –OH groups is the wide 1H shielding range and the possibility to classifychemical shifts. It is particularly interesting that the shileding range of the –OH absorptions (8- 15 ppm) extents significantly the range of the 1H chemical shifts of the aliphatic andaromatic protons. As a result, the degree of overlapping of the –OH resonances is muchsmaller than in the range of aliphatic and aromatic protons.(d) A comparative study of an olive leaf extract in different solvents and temperaturesdemonstrated the importance of the solvent and temperature on the equilibrium constants ofthe various types of aldehyde forms of oleuropein. (e) The absorptions of the –OH groups, and the cross peaks obtained from 2D 1H-13CHMBC NMR spectra, can be useful tools for the automated via computer programs, analysisof complex extracts of natural products. Further application of the method could also be thearea of metabolomics.

ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΘΗΚΕ Η ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ Η ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (NMR) ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΠΛΟΚΑ ΦΥΤΙΚΑ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ ΧΩΡΙΣ ΤΟΝ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΤΟΥΣ.ΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΣΥΝΟΨΙΖΟΝΤΑΙ ΩΣ ΑΚΟΛΟΥΘΩΣ:(Α) ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΣ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΣΕ ΠΟΛΥΠΛΟΚΑ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ. Η ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΕΠΙΤΕΥΧΘΗΚΕ ΜΕ ΤΗ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ ΔΙΑΛΥΤΗ DMSO-D6, ΠΙΚΡΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ, ΑΡΑΙΩΜΕΝΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΠΛΗΣΙΟΝ ΤΟΥ ΣΗΜΕΙΟΥ ΠΗΞΕΩΣ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΕΠΙΦΕΡΟΥΝ ΣΗΜΑΝΤΙΚΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΝΙΩΝ. ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ, ΕΦΑΡΜΟΣΤΗΚΕ ΕΚΤΕΝΩΣ ΔΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΤΕΧΝΙΚΗ 1H-13C NMR ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΛΗΡΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΣΕ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ, ΧΩΡΙΣ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΠΟΛΥΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΧΡΟΝΟΒΟΡΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΚΑΘΕ ΣΥΣΤΑΤΙΚΟΥ ΧΩΡΙΣΤΑ.(Β) Η ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Δ(1Η) ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΣΕ ΑΛΛΑΓΕΣ ΤΟΥ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΑΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΛΟΓΩ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ ΑΚΟΜΗ ΚΑΙ ΣΕ ΑΠΟΣΤΑΣΗ ΔΩΔΕΚΑ ΔΕΣΜΩΝ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΜΙΑ ΑΡΙΣΤΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΤΕΥΞΗ ΤΗΣ ΠΛΗΡΟΥΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ, ΓΙΑ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΩΝ, ΣΕ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ, ΠΑΡΟΤΙ ΑΡΚΕΤΟΙ ΑΝΘΡΑΚΕΣ ΤΟΥ ΔΟΜΙΚΟΥ ΤΩΝ ΣΚΕΛΕΤΟΥ ΕΧΟΥΝ ΠΑΡΟΜΟΙΕΣ Η ΤΑΥΤΟΣΗΜΕΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΙΣ.(Γ) ΤΑ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΕΦΕΡΑΝ ΣΗΜΑΝΤΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ ΚΑΙ ΚΑΤΗΓΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΕΩΝ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗ ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗ ΦΥΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΔΑΚΤΥΛΙΩΝ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ. ΒΑΣΙΚΟ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΕΥΡΟΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΑΛΛΑ ΚΑΙ Η ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΚΑΤΗΓΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΕΩΝ. ΕΙΝΑΙ ΙΔΙΑΙΤΕΡΑ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ ΟΤΙ Η ΚΛΙΜΑΚΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ (8 - 15 PPM) ΑΥΞΑΝΕΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΤΗΝ ΚΛΙΜΑΚΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΕΩΝ 1Η ΚΑΙ ΕΙΝΑΙ ΙΣΗ ΜΕ ΤΟ ΕΥΡΟΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΟΝΙΩΝ. ΩΣ ΣΥΝΕΠΕΙΑ, Ο ΒΑΘΜΟΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΚΑΛΥΨΗΣ ΤΩΝ ΚΟΡΥΦΩΝ –ΟΗ ΕΙΝΑΙ ΠΟΛΥ ΜΙΚΡΟΤΕΡΟΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΩΝ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΟΝΙΩΝ. ΤΟ ΓΕΓΟΝΟΣ ΑΥΤΟ ΥΠΟΔΕΙΚΝΥΕΙ ΤΗ ΜΕΓΑΛΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ ΚΑΙ ΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΡΟΛΟ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΔΥΝΑΤΟΝ ΝΑ ΕΧΟΥΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΛΥΠΛΟΚΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ, ΧΩΡΙΣ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ.(Δ) ΑΠΟ ΤΗ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΟΥΣ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ ΠΡΟΕΚΥΨΕ Ο ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΣ ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ ΚΑΙ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΑΛΔΕΫΔΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ.(Ε) ΤΕΛΟΣ, ΤΟΣΟ ΟΙ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ –ΟΗ, ΟΣΟ ΚΑΙ ΟΙ ΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΕΣ ΚΟΡΥΦΕΣ ΔΙΑΣΤΑΥΡΩΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΩΝ 2D 1H-13C HMBC, ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΟΥΝ ΧΡΗΣΙΜΑ ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗ, ΜΕΣΩ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ, ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΛΥΠΛΟΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ. ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΘΑ ΜΠΟΡΟΥΣΕ ΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΕΙ ΚΑΙ Η ΜΕΤΑΒΟΝΟΜΙΚΗ (METABOLOMICS). ΑΥΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΚΑΙ ΜΙΑ ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΠΟΥ ΑΝΑΠΤΥΧΘΗΚΕ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ.