Ποσοτικοποίηση του HIV-DNA σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) φορέων της HIV λοίμωξης

Abstract

The rate of HIV-1 disease progression varies greatly among HIV-1-infected individuals, depending on several factors, such as baseline HIV RNA level, baseline CD4⁺ T-cell level, age at seroconversion, gender, etc. Quantification of HIV-RNA in plasma has routinely been used for assessment of the efficacy of HAART, and it provides a strong predictor of HIV-1 disease progression. The introduction of HAART in clinical practice increased the life expectancy and life quality of HIV-infected patients. Treatment with HAART allows a drastic reduction of the plasma HIV-RNA load, to such an extent that circulating HIV-1 in plasma becomes undetectable (<50 copies/ml) by the most sensitive viral detection assays. Given the drastic reduction of HIV-RNA level in plasma, a new prognostic marker was found, the levels of HIV-1 DNA in PBMCs, which can be used as a prognostic marker for HIV-1 infection. Moreover, in patients with undetectable HIV-RNA level, HIV-1 DNA consists the only marker of viral replication in PBMCs and lymphoid tissues. Several studies have demonstrated that HIV-1 DNA levels can be used as an independed prognostic marker in clinical practice for HIV-infected patients’ management, for disease progression, for optimizing therapy initiation, predicting treatment outcome and long-term success of HAART. The purpose of this study was to investigate the importance of HIV-1 DNA quantification in HIV-infected patients. For this purpose, we review all previously reported assays for HIV-1 DNA quantification as well all the studies investigating its role as an additional marker in HIV-infection and treatment initiation and outcome. Given the fact that there is not a commercially available assay for HIV-1 DNA, we develop an in house real-time PCR assay for HIV-1 DNA quantification in multiplex format with CCR5 reporter gene. The molecular beacon based multiplex real-time PCR assay was developed in LightCycler 2.0® apparatus. Thereafter the multiplex assay was performed in 115 randomly selected patients before HAART initiation, in order to find correlations of HIV-1 DNA baseline level with two other prognostic markers (HIV-RNA and CD4 T-cells count. Finally, a study protocol was set up in order to investigate whether HIV-1 DNA is a prognostic factor of the first line treatment.

Ο ρυθμός εξέλιξης HIV-1 λοίμωξης ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των HIV-1 μολυσμένων ατόμων, καθώς εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως τα αρχικά επίπεδα του HIV-RNA, τα αρχικά επίπεδα του αριθμού των CD4⁺ Τ-λεμφοκυττάρων, η ηλικία του ασθενούς κατά την ορομετατροπή, το φύλλο κλπ. Η ποσοτικοποίηση του ιικού HIV-RNA στο πλάσμα χρησιμοποιείται συνήθως στην κλινική πράξη για τη αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της HAART και παρέχει ένα ισχυρό προγνωστικό δείκτη της εξέλιξης της HIV-1 λοίμωξης. Η έναρξη λήψης για την ώρα μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών και να παρατείνει το προσδόκιμο επιβίωσης. Όμως η χορήγηση της HAART θεραπείας συντελεί στη δραστική μείωση των επιπέδων του HIV-RNA στο πλάσμα, σε τέτοιο βαθμό που το ιικό φορτίο στο πλάσμα γίνεται μη ανιχνεύσιμο (<50 αντίγραφα/ml) ακόμη και από τις πλέον ευαίσθητες μεθόδους προσδιορισμού. Δεδομένου όμως της δραστικής μείωσης των επιπέδων του HIV-RNA στο πλάσμα, έχει βρεθεί ότι ένας επιπλέον δείκτης, το HIV-1 DNA από PBMCs που συσχετίζεται σημαντικά με την πρόγνωση του ρυθμού εξέλιξης της λοίμωξης. Στους ασθενείς με μη ανιχνεύσιμα επίπεδα HIV-RNA, το HIV-1 DNA αποτελεί τον μοναδικό δείκτη ιικού πολλαπλασιασμού σε μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) και λεμφοειδείς ιστούς. Υπάρχουν, ισχυρές ενδείξεις ότι τα επίπεδα του HIV-1 DNA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην κλινική πρακτική, ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της εξέλιξης της νόσου, για την καλύτερη αξιολόγηση για την στιγμή έναρξης της HAART και για την παρακολούθηση της μακροπρόθεσμης επιτυχίας της θεραπείας. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της σημασίας της ποσοτικοποίησης του HIV-1 DNA σε ασθενείς με HIV-1 λοίμωξη. Έτσι, αρχικά πραγματοποιήθηκε ια συστηματική ανασκόπηση της υπάρχουσας αρθρογραφίας για τις μεθοδολογίες που έχουν αναπτυχθεί για την ποσοτικοποίηση του συγκεκριμένου νέου διαγνωστικού δείκτη, καθώς και τις μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί και καταδεικνύουν τη σημασία της ποσοτικοποίησης του HIV-1 DNA στην κλινική πράξη τόσο ως προγνωστικός δείκτης της λοίμωξης, όσο και στην αξιολόγηση της έναρξης και εξέλιξης της HAART θεραπείας. Δεδομένης, όμως, της απουσίας εμπορικά διαθέσιμης μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση του HIV-1 DNA, αναπτύχθηκε μια in house δοκιμασία. Έτσι, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε ένα νέο πρωτόκολλο πολλαπλής (multiplex) real-time PCR (RLT-PCR) για την ποσοτικοποίηση του HIV-1 DNA με ταυτόχρονη ποσοτική εκτίμηση του γονιδίου CCR5. Η δοκιμασία αναπτύχθηκε στη συσκευή του LightCycler 2.0®, ενώ για την ανίχνευση των δύο αλληλουχιών στόχων χρησιμοποιήθηκαν molecular beacons. Η multiplex δοκιμασία εφαρμόστηκε σε 115 τυχαία επιλεγμένους νεοδιαγνωσθέντες HIV-1 ασθενείς πριν από την έναρξη της HAART, προκειμένου να συσχετισθούν τα επίπεδα του HIV-1 DNA με τους άλλους δύο προγνωστικούς δείκτες. Ενώ τέλος, αναπτύχθηκε ερευνητικό πρωτόκολλο προκειμένου να εκτιμηθεί η προγνωστική αξία των επιπέδων του HIV-1 DNA πριν την έναρξη της θεραπείας στην επιτυχία του πρώτου θεραπευτικού σχήματος.