Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων στους ασθενείς με καρδιαγγειακή νόσο: διερεύνηση νέων δεικτών για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας αντιαιμοπεταλιακών παραγόντων

Abstract

Introduction-Purpose: Aspirin in combination with a P2Y12 antagonist has strong antithrombotic activity in the treatment of acute coronary syndromes (ACS). At the same time, they may show various pleiotropic effects which are dependent of platelets or independent of them and are of great importance for the effectiveness of antiplatelet drugs to patients, particularly during their long-term therapy. The purpose of this study was to investigate the pleiotropic actions of aspirin and clopidogrel, and their correlation with traditional assessment of platelet function parameters as well as the phenomenon of resistance. Also, we aimed to highlight any parameters that could be used as diagnostic tools for resistance.Materials and Methods: The study included 118 ACS patients undergoing PCI and receiving dual antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel (loading dose 325mg to 600 or 300mg followed by 100mg / day and 75mg / day, respectively), or aspirin and ticagrelor (loading dose 325mg and 180mg followed by 90mg twice a day, respectively). The resistance to aspirin was determined with LTA upon activation of platelets with arachidonic acid (AA) and clopidogrel resistance was evaluated by the method of phosphorylation VASP (PRI values; platelet reactivity index). Markers identified for investigation of their possible association with resistance include: platelet aggregation at various agonists with LTA method, the levels of thromboxane and sP-selectin by ELISA, the membrane expression of P- selectin (PE-CD62P) and integrin aIIbv3 (binding of FITC-PAC-1) by flow cytometry and cytokine levels using x-map technology. Moreover, adhesion of platelets in whole blood was studied under constant shear stress with Cellix system. Finally, fluorescence spectroscopy method investigated the interaction of clopidogrel with rLp-PLA2 and the effect of this binding on the activity of the enzyme was studied by the method of precipitation with trichloroacetic acid using as substrate [3H] PAF as the sources of the enzyme in total plasma, the low density lipoprotein (LDL) and rLp-PLA2. The consequence of this interaction in the metabolism of the drug was found by mass spectrometry.Results: Dual antiplatelet therapy showed several pleiotropic effects by reducing plasma TxB2 levels and 11-dehydro TxB2 in urine, a reduction of membrane expression of P-selectin and sP-selectin, a reduction of the expression of αIIbβ3 and reduction of plasma cytokines. Also, dual antiplatelet therapy reduced platelet adhesion to collagen and activity of Lp-PLA2 highlighting the pleiotropic effects of these drugs. In accordance with LTA-AA, the frequency of resistance to aspirin was 21%, while according to the analysis VASP 33% of all patients receiving clopidogrel exhibited drug resistance. Among the parameters tested and aggregation in AA, for resistance to aspirin, there was strong correlation for the expression of integrin αIIbβ3 and aggregation to TRAP. Among the parameters tested and VASP phosphorylation levels, membrane expression of P-selectin and TRAP-induced aggregation had strong positive correlation. Conclusion: The antiplatelet drugs may exhibit a variety of pleiotropic actions which are dependent of platelets, for example by reducing key platelet activation markers or/and reduce its adhesion to collagen and independent of platelet effects such as reducing the activity of Lp-PLA2. From this study, TRAP and PAC-1 and TRAP, PAC-1 and P-selectin could become new diagnostic tools for aspirin and clopidogrel resistance, respectively.

Εισαγωγή-Σκοπός: Η ασπιρίνη σε συνδυασμό με έναν P2Y12 ανταγωνιστή έχει ισχυρή αντιθρομβωτική δράση στην αντιμετώπιση των οξέων στεφανιαίων συνδρόμων (ΟΣΣ). Παράλληλα, μπορεί να εμφανίζουν ποικίλες πλειοτροπικές δράσεις είτε εξαρτώμενες από τα αιμοπετάλια είτε ανεξάρτητες από αυτά με μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα των αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων στους ασθενείς, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της μακροχρόνιας χορήγησής τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των πλειοτροπικών δράσεων της ασπιρίνης και της κλοπιδογρέλης και η συσχέτισή τους με τις κλασικές παραμέτρους εκτίμησης της αιμοπεταλιακής λειτουργίας καθώς και με το φαινόμενο της αντίστασης. Επίσης, σκοπός ήταν η ανάδειξη κάποιων παραμέτρων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες διάγνωσης της αντίστασης.Υλικά και μέθοδοι: Στη μελέτη συμπεριελήφθησαν 118 ΟΣΣ ασθενείς που υποβλήθηκαν σε PCI και έλαβαν διπλή αντιαιμοπεταλιακή αγωγή με ασπιρίνη και κλοπιδογρέλη (δόση φόρτισης 325mg και 600 ή 300mg ακολουθούμενη από 100mg/ημέρα και 75mg/ημέρα, αντίστοιχα) ή ασπιρίνη και τικαγρελόρη (δόση φόρτισης 325mg και 180mg ακολουθούμενη από 90mg 2 φορές ημερησίως, αντίστοιχα). Η αντίσταση στην ασπιρίνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο LTA μετά από ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) ενώ η αντίσταση στην κλοπιδογρέλη εκτιμήθηκε με τη μέθοδο φωσφορυλίωσης VASP (τιμές PRI; platelet reactivity index). Στους δείκτες που προσδιορίστηκαν για τη διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης τους με την αντίσταση περιλαμβάνονται: η συσσώρευση των αιμοπεταλίων σε διάφορους αγωνιστές με τη μέθοδο συσσωρευομετρίας, τα επίπεδα του TxB2 στο πλάσμα και του 11-δεϋδρο TxB2 στα ούρα καθώς και της sP-σελεκτίνης με τη μέθοδο της ELISA, η μεμβρανική έκφραση της P- σελεκτίνης (PE-CD62P) και της ιντεγκρίνης αIIbβ3 (πρόσδεση FITC-PAC-1) με κυτταρομετρία ροής και τα επίπεδα των εκκρινόμενων δεικτλων της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (IL-1β, IL-8, VEGF, RANTES, GM-CSF) με τη μέθοδο της της μικροσωματιδιακής ανοσοενζυμικής τεχνολογίας. Επιπλέον, η μελέτη της προσκόλλησης των αιμοπεταλίων έγινε σε ολικό αίμα υπό συνεχή διατμητική τάση με το σύστημα Cellix. Τέλος, με τη μέθοδο φασματοσκοπίας φθορισμού διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση της κλοπιδογρέλης με την rLp-PLA2 ενώ η επίδραση αυτής της πρόσδεσης στην ενεργότητα του ενζύμου μελετήθηκε με τη μέθοδο ιζηματοποίησης με τριχλωροξεικό οξύ χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα [3Η]PAF και ως πηγές του ενζύμου το ολικό πλάσμα, την χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (LDL) και την rLp-PLA2. Η συνέπεια της αλληλεπίδρασης αυτής στο μεταβολισμό του φαρμάκου διαπιστώθηκε με φασματομετρία μάζας.Αποτελέσματα: Η διπλή αντιαιμοπεταλιακή αγωγή εμφάνισε διάφορες πλειοτροπικές δράσεις με τη μείωση των επιπέδων του TxB2 στο πλάσμα και του 11-δεϋδρο TxB2 στα ούρα, τη μείωση της μεμβρανικής έκφρασης της P-σελεκτίνης και της sP-σελεκτίνης, τη μείωση της έκφρασης του αIIbβ3 και τη μείωση των εκκρινόμενων δεικτών των αιμοπεταλίων του πλάσματος. Επίσης, μείωσε την αιμοπεταλιακή προσκόλληση στο κολλαγόνο καθώς και την ενεργότητα της Lp-PLA2 αναδεικνύοντας τις πλειοτροπικές δράσεις των φαρμάκων αυτών. Σύμφωνα με τη μέθοδο LTA, η συχνότητα αντίστασης στην ασπιρίνη ήταν 21% ενώ σύμφωνα με την ανάλυση VASP το 33% του συνόλου των ασθενών που έλαβαν κλοπιδογρέλη εμφάνισαν αντίσταση στο φάρμακο. Ανάμεσα στις παραμέτρους που εξετάστηκαν και τη συσσώρευση στο AA, για την αντίσταση στην ασπιρίνη δεν παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση παρά μόνο για την έκφραση της ιντεγκρίνης αIIbβ3 και της συσσώρευσης από το TRAP. Ανάμεσα στις παραμέτρους που εξετάστηκαν και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της VASP παρουσιάστηκε ισχυρή θετική συσχέτιση με πολλές από αυτές με τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και της επαγόμενης από το TRAP συσσώρευσης να ξεχωρίζουν. Συμπέρασμα: Τα αντιαιμοπεταλιακά φάρμακα μπορεί να εμφανίζουν ποικίλες πλειοτροπικές δράσεις εξαρτώμενες από τα αιμοπετάλια με τη μείωση χαρακτηριστικών δεικτών ενεργοποίησης αιμοπεταλίων και τη μείωση της προσκόλλησης τους στο κολλαγόνο καθώς και δράσεις ανεξάρτητες των αιμοπεταλίων όπως η μείωση της ενεργότητας της Lp-PLA2. Από τη μελέτη αυτή, αναδεικνύονται νέοι δείκτες διάγνωσης της αντίστασης στην ασπιρίνη (TRAP, PAC-1) και την κλοπιδογρέλη (TRAP, PAC-1, P-σελεκτίνη).