Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για τον προσδιορισμό αντιοξειδωτικών ενώσεων σε σιτηρά

Abstract

Recently, there is a growing interest of the consumer in consumption of natural products like cereals, which are rich in natural antioxidants. In the present work, different methods for the analysis of antioxidant compounds in various cereal samples using high performance liquid chromatography (HPLC), have been developed and validated. An HPLC reversed phase method has initially been developed for the simultaneous determination of tocopherols and tocotrienols isomers (α-, (β+γ)- and δ-) and carotenoids (lutein and β-carotene) in cereal samples after solid phase extraction, with total analysis time < 16 min. Thereafter, a reversed phase HPLC method with fluorescence detection has been developed and validated for the resolution of β- and γ- isomers of tocols. Analytes were separated on a PerfectSil Target ODS-3 and the separation of β- and γ- isomers was optimized in terms of mobile-phase composition and column temperature. Afterwards, an HPLC-DAD method has been developed and validated for the determination of phenolic acids, like gallic, protocatechuic, 4-hydroxybenzoic, vanillic, caffeic, syringic, p-coumaric, ferulic, sinapic, salicylic and cinnamic acid in cereals in either free form after solid phase extraction or bound form after alkaline hydrolysis. Continuously, an analytical method based on an optimized solid-phase extraction procedure and followed by HPLC separation with diode array detection (DAD) was developed and validated for the simultaneous determination of 10 phenolic acids and 12 flavonoids (catechin, epicatechin, myricetin, quercetin, kaempferol, quercetin-3-O-glucoside, hyperoside, rutin, luteolin, apigenin, naringenin and hesperidin) in rice flour (Oryza sativa L.). Finally, the developed methods have been applied to different varieties of pigmented and non-pigmented rice for the determination of antioxidant compounds and the evaluation of their antioxidant potential. The results showed that the pigmented rice may become an important source of food bioactives, and has the potential to be used as valuable ingredient in functional food formulations with enhanced nutraceutical properties. In conclusion the analytical methods described in the present thesis offer several advantages including: a simple, time- and cost- effective pretreatment of the samples, high precision and accuracy as well as satisfactory recoveries. Additionally, the proposed methods can be a useful tool for the screening of antioxidant compounds in cereal products (raw materials and processed foods).

Τα τελευταία χρόνια υπάρχει ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον από τους καταναλωτές για τα φυσικά προϊόντα όπως τα σιτηρά, που αποτελούν πλούσιες πηγές φυσικών αντιοξειδωτικών. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν μέθοδοι υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (ΗPLC) για τον προσδιορισμό αντιοξειδωτικών ενώσεων σε δείγματα σιτηρών. Αρχικά αναπτύχθηκε μέθοδος ΗPLC αντίστροφης φάσης για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των α-, (β+γ)- και δ-τοκοφερολών και τοκοτριενολών και καροτενοειδών (λουτεΐνης και β-καροτένιο) σε δείγματα σιτηρών μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης, με συνολικό χρόνο ανάλυσης < 16 min. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μέθοδος διαχωρισμού των β- και γ- ισομερών των τοκολών που βασίστηκε στην προσθήκη νερού στην κινητή φάση και στη ρύθμιση της θερμοκρασίας της στήλης, χρησιμοποιώντας την αναλυτική στήλη PerfectSil Target ODS-3. Ακολούθησε η ανάπτυξη και επικύρωση ΗPLC-DAD μεθόδου για τον προσδιoρισμό φαινολικών οξέων, όπως γαλλικό, πρωτοκατεχικό, 4-υδροξυβενζοϊκό, βανιλλικό, καφεϊκό, συρινγκικό, p-κουμαρικό, φερουλικό, σιναπικό, σαλικυλικό και κιναμμωμικό οξύ σε δείγματα σιτηρών είτε σε ελεύθερη μορφή μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης, είτε σε δεσμευμένη μορφή μετά από αλκαλική υδρόλυση. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μέθοδος ΗPLC με ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (DAD) για τον ταυτόχρονο προσδιoρισμό 10 φαινολικών οξέων και 12 φλαβονοειδών (κατεχίνη, επικατεχίνη, κερκετίνη, καμφερόλη, μυρικετίνη, γλυκοζίτης κερκετίνης, ρουτινοζίτης κερκετίνης, ρουτίνη, απιγενίνη, λουτεολίνη, ναρινγκενίνη και εσπεριδίνη) σε ρύζι μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης. Στο τέλος έγινε εφαρμογή των αναπτυσσόμενων μεθόδων σε δείγματα έγχρωμων (πλούσιων σε αντιοξειδωτικά) και άχρωμων δειγμάτων ρυζιού για το χαρακτηρισμό των φυτοχημικών ενώσεων και την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητάς τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το έγχρωμο ρύζι αποτελεί σημαντική πηγή αντιοξειδωτικών ενώσεων και μπορεί να θεωρηθεί ως ένα καινοτόμο συστατικό τροφίμων με ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου. Όλοι οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν χαρακτηρίζονται από απλή προκατεργασία δειγμάτων, σύντομη και απλή διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης, ικανοποιητική ακρίβεια και επαναληψιμότητα και δυνατότητα εφαρμογής από αναλυτικά εργαστήρια για την αξιολόγηση των αντιοξειδωτικών ενώσεων των σιτηρών.