Ανάπτυξη μεθόδων πολλαπλής ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων και εφαρμογές στη μοριακή διαγνωστική

Abstract

The aim of the present doctoral thesis is the development of novel multianalyte hybridization assays for nucleic acid detection as well as the development of signal amplification systems for the improvement of the sensitivity of hybridization assays. In the theoretical part of this thesis, a bibliographic review on the widely applied multianalyte techniques for the detection of nucleic acid is presented, focusing on the single nucleotide polymorphisms’ (SNPs) detection (chapter 1). A brief description of the methods along with parameters such as multiplicity, duration of the assays and simplicity of analysis, are outlined. In chapter 2, the attempts that have been made in the last ten years, towards the development of highly sensitive hybridization assays are presented. Finally, in chapter 3, dry reagent dipstick hybridization assays are described, focusing on the preparation and application protocols, as well as on the multiplicity of the rapid tests.The experimental part of this thesis consists of 5 chapters. Instrumentation, reagents and methods are presented in chapter 4. The development of multianalyte chemi(bio)luminometric method for the simultaneous detection of two SNPs (four allelic variants) is described in chapter 5. PCR for the TLR4 gene was designed in such a way that both SNPs were present in the amplified fragment. However, the loci of the two SNPs need not be contiguous, since a duplex PCR can be performed providing two amplified fragments that contain the loci of interest. As little as 1 μL of PCR product is sufficient for the quadruple PEXT reaction without the need for prior purification. The PEXT reaction products are used directly (without purification) for the microtiter well-based quadruple chemiluminometric assay. The time required for the quadruple PEXT reaction and chemiluminometric assay is 15 min and 75 min, respectively. The cost of the method is considerably reduced by performing four PEXT reactions in the same tube followed by four assays of PEXT products in the same well. The microtiter plate assay format facilitates greatly automation of the genotyping method and provides a high sample throughput. The proposed method was validated by genotyping 46 samples (a total of 184 allelic variants). The samples were also analyzed by direct sequencing of the amplified DNA. The genotypes derived from the proposed method were in full agreement with sequencing data.Chapter 6 describes our efforts towards signal amplification systems for nucleic acid detection by means of DNA/protein conjugated microspheres as reporter moieties in hybridization assays. Initially, various conjugation protocols for the preparation of microsphere conjugates with oligonucleotide and proteins were tested. The prepared conjugates were analyzed by conventional hybridization assays. The results indicated that as few as 250 or 700 microspheres (beads diameter 2 and 1 μm, respectively) can be detected bioluminometrically. This corresponds to zmol quantity of nucleic acid molecules. The attempt to use microsphere conjugates as reporter molecules in hybridization assays was not successful. An attempt to explain the cause of this failure was made on the basis of additional experimental work together with bibliographic data on the same matter. The use of microsphere/oligonucleotide conjugates for the development multianalyte dry-reagent hybridization assays are described in chapter 7. Microspheres are used as carriers for the immobilization of nucleotide probes on nitrocellulose diagnostic membrane. The multianalyte dry-reagent strip was initially applied for the simultaneous detection of five SNPs (10 allelic variants), after an extensive study of the parameters affecting the dipstick assay, as well as the 10plex primer extension genotyping reaction. The visual detection of each of the ten products at the particular site of the membrane is accomplished by specific hybridization of target with immobilized complementary oligonucleotide and anti-biotin conjugated gold nanoparticles. The genotype of each polymorphism is determined by the coordinates and the number of the corresponding test spots. The method was evaluated by analyzing characterized synthetic samples and the results were found in accordance with those obtained by the reference method (DNA sequencing).Finally, the development of multianalyte dry-reagent test strip for the simultaneous detection of multiple DNA-targets is described in chapter 8. Seven DNA-targets were used as models for the method development. Direct hybridization of double-stranded (biotinylated) PCR products (after thermal denaturation) was not successful for all DNA-targets. On the other hand, single-stranded DNA, such as asymmetric PCR products, was successfully detected by hybridization with target specific-probes on the membrane. However, asymmetric PCR of multiple targets in the same tube is not a simple task. For this reason, the detection of multiple targets was accomplished by conventional multiplex PCR followed by multiplex PEXT reaction of the mixture in the presence of target-specific primers that carry recognition tags (for the immobilization on the membrane) and biotin-dUTP. Immobilized biotinylated products are detected by AB-conjugated gold nanoparticles. As few as 500 amol of each DNA-target could be detected by the proposed dipstick-assay. The proposed dipstick-assay can be used for the detection of any DNA sequence, using appropriate probes and primers.

Το θεωρητικό μέρος της παρούσας διαδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει βιβλιογραφική ανασκόπηση των ευρύτερα χρησιμοποιούμενων τεχνικών πολλαπλής ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων που εστιάζονται στο πεδίο ανίχνευσης σημειακών πολυμορφισμών (κεφάλαιο 1). Δίνεται συνοπτική περιγραφή της αρχής των μεθόδων αυτών και παρατίθενται τα κυριότερα αναλυτικά χαρακτηριστικά τους με επίκεντρο τις δυνατότητες πολλαπλότητας που παρέχουν, καθώς και στο χρόνο ανάλυσης και την απλότητα των τεχνικών. Στην συνέχεια, παρουσιάζονται οι ερευνητικές προσπάθειες των τελευταίων δέκα χρόνων στο πεδίο ανάπτυξης μεθόδων ανίχνευσης DNA υψηλής ευαισθησίας (κεφάλαιο 2). Περιγράφονται τα σημαντικότερα εκ των νέων συστημάτων ανίχνευσης που έχουν αναπτυχθεί με εκτενή αναφορά και σχολιασμό των αναλυτικών χαρακτηριστικών τους (όρια ανίχνευσης, δυνατότητα πολλαπλής ανίχνευσης κ.α.). Τέλος, στο κεφάλαιο 3 περιγράφονται δοκιμασίες υβριδισμού σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων, εστιάζοντας στον τρόπο παρασκευής και εφαρμογής τους, αλλά κυρίως στα πρωτόκολλα που αφορούν στην ταυτόχρονη οπτική ανίχνευση πολλών στόχων-DNA (με μέγιστο αριθμό 4 αλληλουχίες-στόχους).Στο πειραματικό μέρος, παρατίθεται η οργανολογία και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Επίσης, περιγράφονται τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν (κεφάλαιο 4).Η ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονης ανίχνευσης δύο σημειακών πολυμορφισμών παρουσιάζεται στο κεφάλαιο 5. Η μέθοδος αποτελείται από τρία επιμέρους στάδια. Αρχικά, η περιοχή που φέρει τους πολυμορφισμούς του υπό εξέταση γονιδίου ενισχύεται μέσω PCR. Το προϊόν PCR, ακολούθως, υποβάλλεται σε τετραπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή (ΡΕΧΤ), παρουσία δύο ζευγών αλληλοειδικών εκκινητών στο ίδιο μίγμα αντίδρασης και ιχνηθετημένου με βιοτίνη dUTP. Τέλος, τα προϊόντα της αντίδρασης γονοτύπισης ανιχνεύονται με τετραπλή χημειο(βιο)φωταυγειομετρική δοκιμασία υβριδισμού στην επιφάνεια φρεατίων μικροτιτλοδότησης επιστρωμένων με στρεπταβιδίνη. Η ιχνηθέτηση των εκκινητών με τέσσερεις διακριτές ετικέτες (απτένια ή συνθετικές αλληλουχίες), επιτρέπει την ειδική αναγνώριση των προϊόντων επέκτασης από ισάριθμα συζεύγματα των μορίων ανιχνευτών (AEQ, HRP, β-GAL, ALP). Ο καθορισμός του γονότυπου κάθε πολυμορφισμού πραγματοποιείται με υπολογισμό του λόγου των σημάτων των προϊόντων επέκτασης παρουσία φυσιολογικού και μεταλλαγμένου εκκινητή, αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκε διεξοδική μελέτη των παραμέτρων που επιδρούν στην απόδοση και ειδικότητα της πολλαπλής γονοτυπικής αντίδρασης και η μέθοδος αξιολογήθηκε με την ανάλυση 46 χαρακτηρισμένων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με αυτά της μεθόδου αναφοράς (αλληλούχιση DNA).Στο κεφάλαιο 6 παρουσιάζονται μελέτες διερεύνησης της δυνατότητας αξιοποίησης συζευγμάτων μικροσφαιριδίων ως ανιχνευτών για την αύξηση της ευαισθησίας δοκιμασιών υβριδισμού. Ως ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν συζεύγματα μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου με ολιγονουκλεοτίδια (για την εξειδικευμένη αναγνώριση των DNA-στόχων), και πρωτεΐνες, όπως η AEQ, για την παραγωγή του αναλυτικού σήματος, Λόγω αντικατάστασης ενός μορίου ιχνηθέτη με χιλιάδες μορίων του στην επιφάνεια του μικροσφαιριδίου αναμένεται σημαντική ενίσχυση του αναλυτικού σήματος. Αρχικά, δοκιμάστηκε σειρά πρωτοκόλλων σύζευξης μικροσφαιριδίων με πρωτεΐνες και ολιγονουκλεοτίδια για την επιλογή του καταλληλότερου. Η ποιότητα των συζευγμάτων αξιολογήθηκε με τη βοήθεια συμβατικών δοκιμασιών υβριδισμού. Τα αποτελέσματα των μελετών έδειξαν ότι είναι δυνατή η βιοφωταυγειομετρική ανίχνευση μόλις 250 και 700 μικροσφαιριδίων διαμέτρου 2 και 1 μm, αντίστοιχα, που αντιστοιχεί σε ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων σε επίπεδα της τάξης των zmol. Η προσπάθεια αξιοποίησης μικροσφαιριδίων (συζευγμένων με μόρια ιχνηθέτες) ως ανιχνευτών δεν οδήγησε στην αναμενόμενη αύξηση της ευαισθησίας. Για το λόγο αυτό, έγινε προσπάθεια ερμηνείας των αποτελεσμάτων με βάση τόσο τα πειραματικά δεδομένα όσο και τα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Τέλος, αναπτύχθηκε θεωρία σύμφωνα με την οποία η κατακράτηση σφαιριδίων είναι εφικτή μόνο μέσω πολλαπλών γεφυρών υβριδίων DNA. Επίσης, μελετήθηκαν βιβλιογραφικές πηγές που υποστηρίζουν την έντονη επίδραση μηχανικών διεργασιών στην σταθερότητα υβριδίων μεταξύ σφαιριδίων.Τα συζεύγματα μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου με ολιγονουκλεοτίδια αξιοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως μέσο ακινητοποίησης ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων πρόσδεσης σε διαγνωστικές μεμβράνες για την ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης πολλαπλών DNA-στόχων σε ταχείες δοκιμασίες υβριδισμού τύπου ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων (κεφάλαιο 7). Η νέα μέθοδος απόθεσης στηρίζεται στο μηχανικό εγκλωβισμό των σφαιριδίων (2 μm) στους πόρους μεμβράνης νιτροκυταρίνης (5 μm), σε αντιδιαστολή με την προσρόφηση DNA που εφαρμόζεται ευρέως. Η νέα ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, εφαρμόστηκε αρχικά για την ανίχνευση πέντε σημειακών πολυμορφισμών, μελετώντας τις παραμέτρους που επιδρούν τόσο στη δοκιμασία υβριδισμού, όσο και στην 10πλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Η ανίχνευση καθενός εκ των δέκα προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή πραγματοποιείται οπτικά, με ακινητοποίηση του κάθε αλληλο-ειδικού εκκινητή σε αντίστοιχη θέση στην επιφάνεια της μεμβράνης μέσω υβριδοποίησης και ανίχνευση των βιοτινιλυομένων προϊόντων επέκτασης με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντιβιοτίνη (ΑΒ). Ο γονότυπος κάθε πολυμορφισμού καθορίζεται από τις συντεταγμένες των αντίστοιχων ερυθρών κηλίδων δοκιμασίας. Η αξιολόγηση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε με γονοτύπιση χαρακτηρισμένων συνθετικών δειγμάτων και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε συμφωνία με αυτά της μεθόδου αναφοράς (αλληλούχιση DNA). Επίσης, πραγματοποιήθηκε εκτενής συγκριτική μελέτη μεταξύ των δύο μεθόδων απόθεσης ξηρών αντιδραστηρίων.Τέλος, περιγράφεται μια γενικότερη εφαρμογή της νέας δοκιμασίας υβριδισμού σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων (κεφάλαιο 8). Ως μοντέλα αλληλουχίες-στόχοι χρησιμοποιήθηκαν προϊόντα PCR των γονιδίων TLR4, JAK2, MBL2, ιμβερτάσης και ανασυνδυασμένου γονιδίου ΝΚ καλαμποκιού, λεκτίνης και περιοχής του υποκινητή 35S σόγιας. Αρχικά, διερευνήθηκε η δυνατότητα άμεσου υβριδισμού των θερμικά αποδιατεταγμένων προϊόντων PCR στην ταινία και η ανίχνευσή τους με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ΑΒ. Τα αποτελέσματα της μελέτης οδήγησαν στην αναγκαιότητα διεξαγωγής ασύμμετρης PCR για την ανίχνευση των προϊόντων, προσέγγιση η οποία συνοδεύεται από δυσκολίες, ειδικά στην περίπτωση αυξημένης πολλαπλότητας της μεθόδου. Για τον λόγο αυτό, η σύνθεση μονόκλωνων προϊόντων ιχνηθετημένων με βιοτίνη επιχειρήθηκε μέσω πολλαπλής αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Η αναγκαιότητα ενός επιπλέον σταδίου μεταξύ της PCR και της δοκιμασίας υβριδισμού αντισταθμίζεται από την ποιότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων, ενώ μπορεί να θεωρηθεί, ότι ο επιπλέον χρόνος για τη διεξαγωγή της PEXT (~18 min) ισοδυναμεί με τον χρόνο των επιπλέον κύκλων της ασύμμετρης PCR, που απαιτούνται για την έναρξη σύνθεσης του μονόκλωνου προϊόντος. Με τη μέθοδο αυτή υπάρχει δυνατότητα επέκτασης του αριθμού των στόχων-DNA που μπορούν να ανιχνευτούν ταυτόχρονα, ενώ η απόδοση της αντίδρασης ΡΕΧΤ δεν επηρεάζεται από τον σχεδιασμό των προϊόντων PCR. Είναι δυνατή η οπτική ανίχνευση μέχρι και 500 amol καθενός από τους στόχους-DNA. Η ταινίες που αναπτύχθηκαν είναι γενικής χρήσης και μπορούν να εφαρμοστούν για την ανίχνευση οποιωνδήποτε αλληλουχιών DNA, με επιλογή κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδίων πρόσδεσης και εκκινητών.