Νέες μέθοδοι ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων

Abstract

This doctoral thesis is focused on the development of novel dry-reagent dipstick-type tests for the simultaneous visual detection of two amplified nucleic acid products and two alleles in single nucleotide polymorphisms (SNPs). The strip comprises two test zones and a control zone. Oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles are used as reporters. Dry-reagent dipstick tests are suitable for the routine clinical laboratory and/or point-of-care testing (POC). The theoretical part of this thesis consists of 3 chapters. Chapter 1 describes the technologies for nucleic acid analysis, focusing on analysis with rapid diagnostic dry-reagent tests and their applications. Chapter 2 refers to allele discrimination strategies and SNP genotyping technologies by giving examples of SNP genotyping by means of dry-reagent strip tests. In chapter 3, the rules and regulations for GMOs testing and molecular techniques for the detection of GMOs are described. The experimental part of this thesis consists of 5 chapters. Instrumentation, reagents and methods that were used in the experimental part, are described in chapter 4. Chapter 5 describes the development of the dry-reagent dipstick test that combines the highly specific molecular recognition properties of oligonucleotides with the unique optical properties of gold nanoparticles for the simultaneous visual detection of two nucleic acids. Gold nanoparticles are red due to the plasmon resonance peak at 520 nm. The strip comprises two test zones (SA, anti-Dig) and a control zone (dA)x. The studies were focused mainly on the antibody test zone. Moreover, the composition of the developing solution was studied and the appropriate diagnostic membrane was chosen. Chapter 6 describes the development of a dual-allele dipstick assay for genotyping single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction (PEXT). The proposed PEXT-dipstick assay involves exponential amplification of the genomic region that spans the SNP of interest, two PEXT reactions using allele-specific primers in the presence of dig-dUTP and biotin-dUTP, and detection with only one dry-reagent dipstick. Optimization studies of PEXT reaction conditions and the performance of the genotyping dipstick were carried out. The proposed dual-allele dry-reagent dipstick test was evaluated by genotyping four SNPs as follows: 33 samples for SNP TLR4-299, 28 for TLR4-399, 9 for TPMT*2 and 12 for CYP2C19*3. The genotyping results showed 100% concordance with direct DNA sequencing. The overall reproducibility of the genotyping method (%CV) was found to be 11 and 19% for the test zones T1 and T2, respectively. Chapter 7 describes the development of rapid method for genotyping of JAK2 (V617F) acquired somatic mutation by allele-specific PCR and dual-allele dipstick assay. DNA samples are amplified by tri-primer allele-specific PCR. Digoxigenin- and biotin- labeled amplified products hybridize with target specific probes that carry at their 3΄ end poly(dA) tail. The hybrids are detected visually by the dual-analyte dipstick test. Optimization studies of allele-specific PCR, hybridization conditions and strip detection performance were carried out. 43 samples from patient with chronic myeloproliferative diseases were genotyped and the results were in concordance with those obtained by other genotyping methods. ...............................................................................

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναπτύχθηκε βιοαισθητήρας διπλής οπτικής ανίχνευσης τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, ο οποίος βασίζεται στη χρήση νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με ολιγονουκλεοτίδια ως ανιχνευτών και επιτρέπει την οπτική ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων και πολυμορφισμών/μεταλλάξεων των γονιδίων. Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων είναι κατάλληλες για αναλύσεις ρουτίνας κλινικών εργαστηρίων και για δοκιμασίες «point-of-care» (POC). Το θεωρητικό μέρος της διατριβής αποτελείται από 3 κεφάλαια. Στο κεφάλαιο 1 περιγράφονται μέθοδοι ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων με έμφαση στην ανάλυση με ταχείες διαγνωστικές δοκιμασίες με ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων καθώς και ορισμένες εφαρμογές τους. Το κεφάλαιο 2 αναφέρεται στη σημασία των σημειακών πολυμορφισμών και σε μεθόδους γονοτυπικής διάκρισης αλληλίων. Στο κεφάλαιο 3 περιγράφονται οι γενικές αρχές και η ισχύουσα νομοθεσία για τους γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς, καθώς και οι μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης τους. Το πειραματικό μέρος της διατριβής αποτελείται από 5 κεφάλαια. Στο κεφάλαιο 4 περιγράφεται η οργανολογία, τα αντιδραστήρια και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος. Στο κεφάλαιο 5 περιγράφεται η ανάπτυξη ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων διπλής οπτικής ανίχνευσης, η οποία συνδυάζει την εξειδικευμένη υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων με τις μοναδικές οπτικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων χρυσού για την ανίχνευση μορίων DNA. Τα νανοσωματίδια χρυσού εμφανίζουν χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα στα 520 nm, λόγω συντονισμού των φωτονίων με τα αγώγιμα ηλεκτρόνια των σωματιδίων (πλασμόνια). Στη διαγνωστική μεμβράνη της ταινίας περιλαμβάνονται δύο ζώνες δοκιμασίας (SA, anti-Dig) και μία ζώνη ελέγχου (dA)x. Οι μελέτες βελτιστοποίησης της ταινίας εστιάστηκαν στη ζώνη δοκιμασίας του αντισώματος. Επιπλέον, μελετήθηκε η σύσταση του διαλύματος ανάπτυξης και επιλέχθηκε η κατάλληλη διαγνωστική μεμβράνη. Στο κεφάλαιο 6 περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού δύο αλληλίων με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διπλής οπτικής ανίχνευσης και αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Η μέθοδος περιλαμβάνει εκθετική ενίσχυση με PCR τμήματος του γονιδίου που περιέχει τον πολυμορφισμό, δύο αντιδράσεις PEXT χρησιμοποιώντας εκκινητές συμπληρωματικούς ως προς το κάθε ένα αλλήλιο παρουσία επισημασμένων δεοξυνουκλεοτιδίων (biotin-dUTP και dig-dUTP) και ανίχνευση των προϊόντων PEXT με μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Στα πλαίσια ανάπτυξης της μεθόδου πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των αντιδράσεων PEXT τόσο στο μίγμα της αντίδρασης όσο και στο πρόγραμμα της επέκτασης στο θερμικό κυκλοποιητή, καθώς επίσης και της ταινίας για τη διεξαγωγή του γονοτυπικού προσδιορισμού. ..............................................................................