Νέες τεχνικές ανάλυσης ειδικών αλληλουχιών DNA και RNA

Abstract

The detection and quantification of specific nucleic acid sequences are based on the hybridization (molecular recognition) of the analyte with a complementary DNA or RNA that is linked, directly or indirectly, to an appropriate label for signal generation. The spectrum of applications of hybridization assays expands rapidly as a result of the progress of the Human Genome project. The present dissertation focuses both on the development of multianalyte fluorometric hybridization assays and the simplification of hybridization assays by using a DNA biosensor. In Chapter 1, the principles of polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) are described. PCR and RT-PCR are the most widely used techniques for the exponential amplification of specific DNA and RNA sequences and as a result they have become an essential step of every method for nucleic acid analysis. The principle of quantitative PCR as well as various methods for determination of PCR products is also described in this chapter. Chapter 2 focuses on the principle of hybridization assays which constitute the cornerstone of the analytical chemistry of DNA and RNA. A description is given of the evolution of the various labels from the radioisotopes to the recent nonradioactive labels that offer high detectability and allow assay automation. The homogeneous and heterogeneous hybridization assays are also presented in various configurations. Chapter 3 describes the principles and instrumentation of flow cytometry which is a powerful analytical technique for the study of the properties of microparticles, including cells and synthetic microspheres. The objective of Chapter 4 is the development of multiplex fluorometric hybridization assays for DNA and RNA using a suspension of spectrally distinct polystyrene microspheres (beads). Each microsphere contains two fluorescent dyes in a specified ratio and therefore it becomes a spectrally encoded solid phase for the performance of a heterogeneous hybridization assay. Specific probes are attached covalently on the surface of each bead. The target DNA or RNA is hybridized with the immobilized probes and the hybrids are quantified by using another fluorescent label. The suspension of microspheres is interrogated in the flow cytometer by laser induced fluorescence using two lasers. Hybridization assays of single stranded DNA, double stranded DNA and RNA are developed. Experiments are also performed on the analysis of gene expression in leukemia patients. Chapter 5 presents the first DNA biosensor in a dry-reagent dipstick configuration for the detection of 7 chromosomal translocations that are associated with acute or chronic leukemia. The biosensor is based on oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles and allows visual detection and confirmation of the translocation-specific sequences amplified by RT-PCR. Contrary to the currently used methods for detection of the translocations, the biosensor provides a simple test, it does not require specific instrumentation and avoids multiple incubation and washing steps. Chapter 6 is centered on the development of a DNA hybridization assay for the rapid detection of bacterial infection following arthroplastic surgery, a major problem in orthopedics. The DNA is isolated from synovial fluid, the specific sequences are amplified by PCR using universal primers that hybridize to a highly conserved region and the amplification products are detected by the strip-type biosensor. The method is applied to the detection of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenza, Enterococcus faesium and Streptococcus pneumoniae. Chapter 7 describes the application of the DNA biosensor to the detection of genetically modified organisms (GMO) in food. Although screening of raw ingredients and food products for GMO may be accomplished by detecting either the exogenous DNA or the novel protein, DNA is the preferred analyte because of its superior stability during food processing. The sequences of 35S promoter and NOS terminator, which are present in the majority of GMO, are amplified by PCR and the products are detected by a hybridization assay using the DNA biosensor. Thus, the present work introduces, for the first time, a dipstick-type dry-reagent DNA biosensor to the screening of genetically modified organisms.

Οι μέθοδοι ανίχνευσης και προσδιορισμού ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων βασίζονται στην υβριδοποίηση (μοριακή αναγνώριση) του αναλύτη με συμπληρωματικό μόριο DNA/RNA, το οποίο είναι συνδεδεμένο, άμεσα ή έμμεσα, με κατάλληλο ιχνηθέτη για παραγωγή σήματος. Το φάσμα εφαρμογών των μεθόδων υβριδοποίησης συνεχώς διευρύνεται, κυρίως ως αποτέλεσμα της προόδου των προγραμμάτων προσδιορισμού της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ανθρώπου και άλλων οργανισμών. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι αφενός η ανάπτυξη μεθόδων υβριδοποίησης που παρέχουν τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων και αφετέρου η απλοποίηση των μεθόδων υβριδοποίησης με τη χρήση βιοαισθητήρα DNA. Στο Κεφάλαιο 1 της διατριβής περιγράφεται η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και η αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR) ως οι πιο σημαντικές τεχνικές εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA και RNA, οι οποίες αποτελούν αναπόσπαστο μέρος κάθε σύγχρονης μεθόδου ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Παρουσιάζεται επίσης η τεχνική της ποσοτικής PCR και διάφορες μέθοδοι προσδιορισμού των προϊόντων της PCR. Στο Κεφάλαιο 2 γίνεται παρουσίαση των δοκιμασιών υβριδοποίησης νουκλεϊκών οξέων, οι οποίες αποτελούν και τον ακρογωνιαίο λίθο της αναλυτικής χημείας του DNA και RNA. Περιγράφεται η εξέλιξη των ιχνηθετών από τα ραδιοϊσότοπα μέχρι τους πιο σύγχρονους μη ραδιενεργούς ιχνηθέτες που παρέχουν υψηλή ανιχνευσιμότητα και δυνατότητες αυτοματοποίησης. Παρουσιάζονται οι ομογενείς και ετερογενείς δοκιμασίες υβριδοποίησης και διάφορες παραλλαγές που διευκολύνουν την εκτέλεση τους. Στο Κεφάλαιο 3 παρέχεται σύντομη περιγραφή της αρχής λειτουργίας και της οργανολογίας της κυτταρομετρίας ροής, η οποία αποτελεί ένα ισχυρό αναλυτικό εργαλείο για τη διερεύνηση ιδιοτήτων μικροσωματιδίων (π.χ. κυττάρων αλλά και συνθετικών μικροσφαιριδίων). Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι η ανάπτυξη πολλαπλών φθορισμομετρικών δοκιμασιών υβριδοποίησης DNA και RNA σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Κάθε μικροσφαιρίδιο περιέχει δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία και με αυτό τον τρόπο έχει καταστεί ένα φασματικά κωδικοποιημένο στερεό υπόστρωμα για την εκτέλεση δοκιμασιών υβριδοποίησης. Ειδικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές προσδένονται ομοιοπολικά στην επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου. Η αλληλουχία του DNA- ή RNA-στόχου (αναλύτης) υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια και τα υβρίδια ποσοτικοποιούνται με άλλη φθορίζουσα ουσία. Το εναιώρημα αναλύεται με κυτταρομετρητή ροής με ανιχνευτή φθορισμού επαγώμενου με δύο πηγές λέιζερ. Μελετήθηκε ο προσδιορισμός μονόκλωνου DNA, δίκλωνου DNA και RNA και πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με λευχαιμία. Στο Κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται ο πρώτος βιοαισθητήρας DNA τύπου εμβαπτιζόμενης ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση 7 χρωμοσωμικών αλληλομεταθέσεων, οι οποίες σχετίζονται άμεσα με την οξεία ή τη χρόνια λευχαιμία. Ο βιοαισθητήρας βασίζεται σε ολιγονουκλεοτίδια συζευγμένα με νανοσωματίδια χρυσού και επιτρέπει την ταυτοποίηση των αλληλομεταθέσεων δια γυμνού οφθαλμού, έπειτα από πολλαπλασιασμό με RT-PCR. Σε αντίθεση με τις μέχρι τώρα χρησιμοποιούμενες μεθόδους ανίχνευσης αλληλομεταθέσεων, η ανάλυση με το βιοαισθητήρα είναι απλή, δεν απαιτεί ειδικά όργανα και αποφεύγει πολλά στάδια επωάσεων και εκπλύσεων. Αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 της διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθόδου υβριδοποίησης DNA για την ταχεία ανίχνευση βακτηριακής επιμόλυνσης σε αρθροπλαστικές επεμβάσεις, ένα σημαντικό πρόβλημα στην ορθοπεδική. Απομονώνεται DNA από δείγματα αρθρικού υγρού, ακολουθεί πολλαπλασιασμός με PCR χρησιμοποιώντας καθολικούς εκκινητές και ανίχνευση των προϊόντων με βιοαισθητήρα DNA. Ανιχνεύονται οι μικροοργανισμοί Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenza, Enterococcus faesium και Streptococcus pneumoniae. Στο Κεφάλαιο 7 περιγράφεται η εφαρμογή του βιοαισθητήρα DNA για την ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (GMO) σε τρόφιμα. Αν και η παρουσία GMO μπορεί να διαπιστωθεί με ανίχνευση είτε της νέας πρωτεΐνης που συνθέτει το διαγονιδιακό φυτό ή της αλληλουχίας DNA που έχει εισαχθεί σ’ αυτό, το DNA είναι ο προτιμότερος αναλύτης λόγω της μεγαλύτερης σταθερότητάς του, ιδιαίτερα σε επεξεργασμένα τρόφιμα. Χαρακτηριστικές αλληλουχίες DNA που περιέχονται στα περισσότερα GMO, δηλαδή ο προαγωγέας 35S και ο τερματιστής NOS, πολλαπλασιάζονται με PCR και τα προϊόντα ανιχνεύονται με δοκιμασία υβριδοποίησης στο βιοαισθητήρα DNA. Η παρούσα εργασία εισάγει, για πρώτη φορά στο πεδίο της ανάλυσης GMO, έναν βιοαισθητήρα DNA τύπου εμβαπτιζόμενης ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων.