In vitro μελέτη της επίδρασης των GNRH ανάλογων επί των λειτουργιών των ανθρωπίνων ωχρινοποιημένων κοκκωδών κυττάρων

Abstract

The hypothalamic gonadotropin releasing hormone (GnRH) regulates via pituitary high affinity receptors (GnRHR-I) the biosynthesis and secretion of gonadotropins. In addition to its central action it has been suggested that GnRH exerts peripheral actions since the presence of GnRHR-I has been demonstrated in many extrapituitary tissues including the human ovary. In particular GnRHR-I mRNA has been detected in human granulosa-lutein cells (hGL). On the other hand, the broad use of GnRH analogues by patients undergoing assisted reproductive techniques in ovarian stimulation protocols has raised concerns regarding their possible direct effects on ovarian functions.In the present study we investigated in vitro the effects of GnRH analogues (the GnRH agonist triptorelin and the GnRH antagonist cetrorelix) on the viability and steroidogenesis of cultured hGL cells. Furthermore, we examined their effects on the secretion of two growth factors: the vascular endothelial growth factor (VEFG) and the basic fibroblast growth factor (bFGF). The hGL cells were collected at the time of oocyte retrieval from 52 women (26-40 years old) who participated in IVF cycles due to male or tubal factor infertility. hGL cells were cultured for 48 h with cetrorelix or triptorelin each at concentrations of 1 nM and 3 nM to serum free media. After treatment, the viability was evaluated with the MTT (3,[4,5-dimethylthiazol-2yl]2,3dipheniltetrazolium bromide) assay. Concentrations of estradiol, progesterone VEGF, bFGF in culture supernatants were measured by ELISA.Further experiments with the previous experimental design were performed with the addition of 1 IU of human chorionic gonadotropin (hCG) in the culture medium in order to stimulate the production of steroid hormones and growth factors.Additionally, we investigated in vitro the effects of two GnRH agonists: triptorelin and buserelin as well the effects of cetrorelix on the viability of HGL-5, a human lutein granulosa cell line. HGL-5 cells were cultured for 48 h and treated with or without GnRH agonist or antagonist, each at concentrations of 1 nM and 3 nM, to serum free media. The cell viability was evaluated by the MTT test. Further, we investigated the mRNA expression of GnRHR-I in HGL-5 cells.ABSTRACTviiTreatment of cultured cells with triptorelin induced a slightly increase on the cell viability whereas treatment with cetrorelix led to a significant decrease of hGL cells viability.The high dose of triptorelin reduced the E2 production of hGL cells compared to cells treated with low dose of cetrorelix. Furthermore, cultures treated with 3 nM cetrorelix or triptorelin tended to secrete lower progesterone levels. Regarding the release of VEGF no statistically significant differences were found between cells treated with GnRH analogues and cells incubated with the culture medium only. Treatment with 1 nM of cetrorelix significantly decreased the bFGF levels against control group. The addition of hCG showed not considerably different results compared with the absence of hCG.GnRH analogues did not affect the viability of cultured HGL-5 cells probably due to the truncated form of GnRHR-I that seems to be expressed in this cell line.The results of the present study suggest that the GnRH analogues affect the ovarian functions mainly as it concerns the cell viability and in a minor degree steroidogenesis. The effects seem to vary according to the GnRH analogue and the experimental design.Further research is needed on the possibly different signaling pathways activated by the binding of different GnRH analogues in the transmembrane ovarian receptors.Key Words: GnRH analogues, viability, granulosa luteinized cells, steroidogenesis, VEGF, bFGF

Η υποθαλαμική εκλυτική ορμόνη της γοναδοτροπίνης (GnRH-I) ρυθμίζει την σύνθεση και έκκριση των γοναδοτροπινών μέσω υποφυσιακών υποδοχέων (GnRHR-I). Εκτός της κεντρικής της δράσης πιστεύεται ότι η GnRH-Ι ασκεί και περιφερική δράση καθώς ανακαλύφθηκε ότι εκτός της υπόφυσης οι GnRHR-I εκφράζονται και σε άλλους ιστούς μεταξύ των οποίων και η ωοθήκη. Συγκεκριμένα ανιχνεύθηκε mRNA του GnRHR-I στα ωχρινοποιημένα κοκκώδη κύτταρα της ωοθήκης (hGL). Ταυτόχρονα η ευρεία χρήση των GnRH αναλόγων ιδιαίτερα στα πρωτόκολλα ωοθηκικής διέγερσης για την προετοιμασία των κύκλων εξωσωματικής γονιμοποίησης, ήγειρε ερωτηματικά σχετικά με πιθανές τοπικές επιδράσεις τους επί των κυττάρων της ωοθήκης.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκαν in-vitro οι πιθανές επιδράσεις του GnRH αγωνιστή triptorelin καθώς και του GnRH ανταγωνιστή cetrorelix επί της βιωσιμότητας και της στεροειδογενετικής ικανότητας καλλιεργημένων hGL κυττάρων καθώς επίσης και επί της έκκρισης δυο αυξητικών παραγόντων: του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEFG) και του βασικού ινοβλαστικού αυξητικού παράγοντα (bFGF).Τα hGL κύτταρα απομονώθηκαν από ωοθυλακικό υγρό γυναικών που συμμετείχαν στην διαδικασία της IVF λόγω ανδρικής υπογονιμότητας ή υπογονιμότητας σαλπιγγικής αιτιολογίας. Συνολικά τα κύτταρα προήλθαν από ωοληψίες 52 γυναικών ηλικίας 26 έως 40 ετών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες παρουσία ή απουσία 1 nM ή 3 nM cetrorelix ή triptorelin σε συνθήκες χωρίς προσθήκη αλβουμινών ορού. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με την μέθοδο MTT [βρωμιούχο 3-(4,5-διμεθυλοθειαζολ-2-υλο)-2,5 διφαινυλοτετραζόλιο]. Τα επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης καθώς και του VEGF και BFGF μετρήθηκαν στα υπερκείμενα των καλλιεργειών με την μέθοδο ELISA.Σε μια άλλη σειρά πειραμάτων ακολουθήθηκε ο ίδιος πειραματικός σχεδιασμός με τη διαφορά ότι προστέθηκε 1 IU χοριακή γοναδοτροπίνη (hCG) στο καλλιεργητικό υλικό, ώστε να διεγερθεί η παραγωγή στεροειδών και αυξητικών παραγόντων. Στην συνέχεια τα επίπεδα των στεροειδών ορμονών καθώς και του VEGF και bFGF μετρήθηκαν στα υπερκείμενα των καλλιεργειών με την μέθοδο ELISA.ΠΕΡΙΛΗΨΗvΕπιπλέον ερευνήθηκε η in vitro επίδραση των GnRH αγωνιστών triptorelin και buserelin καθώς και του cetrorelix στην βιωσιμότητα των HGL-5 κυττάρων, μιας ανθρώπινης κυτταρικής σειράς ωχρινοποιημένων κοκκωδών κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 h με ή χωρίς 1 nM ή 3 nM αγωνιστή ή ανταγωνιστή σε συνθήκες χωρίς προσθήκη αλβουμινών ορού. Η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με την μέθοδο MTT. Επίσης στα HGL-5 κύτταρα διερευνήθηκε η έκφραση mRNA του GnRHR-I.Παρατηρήθηκε ότι η χορήγηση triptorelin αύξησε ελαφρώς την βιωσιμότητα ενώ η χορήγηση cetrorelix μείωσε στατιστικώς σημαντικά την βιωσιμότητα κυττάρων. Οι τιμές έκκρισης της E2 μειώθηκαν με την χορήγηση 3 nM triptorelin. Καλλιέργειες όπου χορηγήθηκε υψηλή δόση cetrorelix ή triptorelin τείνουν να εκκρίνουν χαμηλότερη προγεστερόνη. Όσον αφορά την έκκριση του VEGF δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων χορήγησης GnRH αναλόγων και της ομάδας ελέγχου. Χορήγηση 1 nM cetrorelix επέφερε μείωση στις τιμές έκκρισης του bFGF σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Η χορήγηση hCG δεν επέφερε σημαντικά διαφορετικά αποτελέσματα σε σχέση με την μη προσθήκη hCG.Τα GnRH ανάλογα δεν επηρέασαν στατιστικώς σημαντικά την βιωσιμότητα των HGL-5 κυττάρων πιθανώς λόγω του GnRHR-I που φαίνεται πως εκφράζεται διατετμημένος σε αυτήν την κυτταρική σειρά.Τα δεδομένα της παρούσας έρευνας προτείνουν ότι τα GnRH ανάλογα επηρεάζουν τις ωοθηκικές λειτουργίες κυρίως όσον αφορά την βιωσιμότητα των κυττάρων και δευτερευόντως την στεροειδογένεση αλλά το είδος της επίδρασης φαίνεται ότι ποικίλλει ανάλογα με το είδος των GnRH αναλόγων και των πειραματικών συνθηκών καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται.Περαιτέρω μελλοντική έρευνα πρέπει να εστιαστεί στις επιδράσεις που προκαλούνται στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος μετά την πρόσδεση διαφορετικών GnRH αναλόγων στους διαμεμβρανικούς ωοθηκικούς υποδοχείς.Λέξεις κλειδιά: GnRH ανάλογα, ωχρινοποιημένα κοκκώδη κύτταρα, βιωσιμότητα, στεροειδογένεση, VEGF, bFGF.