Μοριακή μελέτη των γονιδίων των πρωτεϊνών του ριβοσωμικού μίσχου, της υπεροξειδικής δισμουτάσης και της κινάσης της καζεΐνης 2 στο μύδι Mytilus galloprovincialis

Περίληψη

tyle=" width: 200px; float: left; ">
div>
Το Μεσογειακό μύδι Mytilus galloprovincialis είναι ένας οργανισμός μεγάλης οικονομικής σημασίας, ιδίως για την Ελλάδα, η οποία κατέχει τη δεύτερη θέση παραγωγής μυδιών στην Ευρώπη, μετά την Ισπανία. Χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης θαλάσσιας ρύπανσης, καθώς παρουσιάζει αυξημένη δυνατότητα συσσώρευσης οργανικών ρύπων στους ιστούς του, οι οποίοι μπορεί να προκαλέσουν σημαντικές δομικές ανωμαλίες στο ριβοσωμικό RNA ή τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες και τελικά αλλαγές στη πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή.Στην εργασία αυτή μελετήθηκε ο ριβοσωμικός μίσχος του μυδιού και η πρωτεϊνική κινάση CΚ2, η οποία είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των P- πρωτεϊνών. Ο ριβοσωμικός μίσχος είναι μια προεξοχή της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελείται από ένα πρωτεϊνικό πενταμερές, Ρ0(Ρ1/Ρ2)2 , που αλληλεπιδρά με τους παράγοντες επιμήκυνσης κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι Ρ-πρωτείνες βρίσκονται φωσφορυλιωμένες στα ριβοσώματα και η φωσφορυλίωση φαίνεται να επηρεάζει την ενεργότητ ...

Όλα τα τεκμήρια στο ΕΑΔΔ προστατεύονται από πνευματικά δικαιώματα.

Το Μεσογειακό μύδι Mytilus galloprovincialis είναι ένας οργανισμός μεγάλης οικονομικής σημασίας, ιδίως για την Ελλάδα, η οποία κατέχει τη δεύτερη θέση παραγωγής μυδιών στην Ευρώπη, μετά την Ισπανία. Χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης θαλάσσιας ρύπανσης, καθώς παρουσιάζει αυξημένη δυνατότητα συσσώρευσης οργανικών ρύπων στους ιστούς του, οι οποίοι μπορεί να προκαλέσουν σημαντικές δομικές ανωμαλίες στο ριβοσωμικό RNA ή τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες και τελικά αλλαγές στη πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή.Στην εργασία αυτή μελετήθηκε ο ριβοσωμικός μίσχος του μυδιού και η πρωτεϊνική κινάση CΚ2, η οποία είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των P- πρωτεϊνών. Ο ριβοσωμικός μίσχος είναι μια προεξοχή της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελείται από ένα πρωτεϊνικό πενταμερές, Ρ0(Ρ1/Ρ2)2 , που αλληλεπιδρά με τους παράγοντες επιμήκυνσης κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι Ρ-πρωτείνες βρίσκονται φωσφορυλιωμένες στα ριβοσώματα και η φωσφορυλίωση φαίνεται να επηρεάζει την ενεργότητα τους. Η φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών πραγματοποιείται από την πρωτεϊνική κινάση CK2, η οποία έχει δομή τετραμερούς (α2β2), και αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (α ή α΄) και μία διμερή β ρυθμιστική υπομονάδα. Η φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών από τη πρωτεϊνική κινάση CK2 αναστέλλεται από την υπεροξειδική δισμουτάση SOD, ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο που συμμετέχει στην άμυνα του οργανισμού έναντι οξειδωτικής βλάβης.Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, αρχικά έγινε βιοχημική ανάλυση των Ρ-πρωτεϊνών MgΡ0, MgΡ1 και MgΡ2 με ηλεκτροφορητικές μεθοδους και ανάλυση κατά Western με ειδικά αντισώματα. Η Ρ0 έχει ΜΒ 32kDa, ενώ οι MgP1 και MgP2 είναι όξινες, μικρού ΜΒ και βρισκονται φωσφορυλιωμένες στα ριβοσώματα. Έλεγχος της ενδογενούς πρωτεΐνης MgΡ0 μετά από έκθεση των μυδιών σε κάδμιο και σορβιτόλη (συνθήκες καταπόνησης-στρες) έδειξε υπερέκφραση, τόσο σε μεταφραστικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο.Ακολούθησε κατασκευή των cDNAs των MgΡ0, MgΡ1, MgΡ2 και MgSOD πρωτεϊνών. Τα MgP0 και MgSOD cDNAs απομονώθηκαν με σάρωση cDNA βιβλιοθήκης, ενώ τα MgP1 και MgP2 κατασκευάσθηκαν με τη μέθοδο RT-PCR. Οι ανασυνδυασμένες MgΡ0, MgΡ1, MgΡ2, MgSOD πρωτεΐνες απομονώθηκαν με έκφραση των cDNA μορίων τους σε κύτταρα Escherichia coli και χρωματογραφία συγγένειας. Επόμενο βήμα της διατριβής ήταν η απομόνωση της υπεύθυνης για τη φωσφορυλίωση των Ρ-πρωτεϊνών πρωτεϊνικής κινάσης CK2. Αρχικά, επιχειρήθηκε απομόνωση της ενδογενούς πρωτεϊνικής κινάσης CK2 από βράγχια του μυδιού M. galloprovincialis με ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία, που οδήγησε στην απομόνωση ενεργών κλασμάτων με την ενδογενή καταλυτική υπομονάδα CK2α. Η παρουσία της CK2α στα κλάσματα επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία κινάσης (kinase assay) και φωσφορυλίωση των ανασυνδυασμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών MgΡ1 και MgΡ2 του μυδιού και ScΡ2β του ζυμομύκητα, καθώς και αναστολή της από ειδικούς αναστολείς (ηπαρίνη και ΤΒΒt) και ενισχυτές (σπερμίνη). Ακολούθησε μοριακή μελέτη της ΜgCK2 με κατασκευή των cDNA μορίων της καταλυτικής ΜgCK2α και της ρυθμιστικής ΜgCK2β υπομονάδας με μεθόδους 5΄και 3΄ RACE και RT-PCR, αντίστοιχα, και απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μετά από έκφραση σε κύτταρα E. coli. Η ανασυνδυασμένη καταλυτική υπομονάδα MgCK2α ήταν λειτουργική και ικανή να φωσφορυλιώνει την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΜgΡ1 του ριβοσωμικού μίσχου, αλλά και την ρυθμιστική ΜgCK2β υπομονάδα, όπως δείχθηκε με δοκιμασία κινάσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, τόσο οι ριβοσωμικές Ρ-πρωτεΐνες, όσο και η πρωτεϊνική κινάση MgCK2 και οι υπομονάδες της μελετήθηκαν και απομονώθηκαν για πρώτη φορά σε θαλάσσια ασπόνδυλα, και ειδικότερα στο μύδι Μ. galloprovincialis.Ο ριβοσωμικός μίσχος ρυθμίζει, ως γνωστόν, την ενεργότητα των ριβοσωμάτων, και η απομόνωση και περαιτέρω μελέτη του ενζύμου CK2 που φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες του θα συμβάλλει στη γνώση μας για το ρόλο του στη μεταφραστική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε φυσιολογικές συνθήκες αλλά και σε συνθήκες καταπόνησης (στρες). Ακόμη, σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα, τόσο η ριβοσωμική πρωτεΐνη Ρ0, όσο και η SOD και η κινάση CK2 του Μ. galloprovincialis είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες θαλάσσιας ρύπανσης.
περισσότερα

Περίληψη σε άλλη γλώσσα

Bivalve molluscs such as Mytilus galloprovincialis have been proposed as bio-indicators of marine pollution, as they are able to accumulate in their tissues a wide range of pollutants and respond with a broad range of alterations that can be measured as exposure or effect biomarkers. Cellular stress caused by environmental contamination has been, also, shown to cause spatial and seasonal variability in global protein synthesis in the mussel M. galloprovincialis.The main purpose of this Ph.D. thesis was to study the P-proteins MgΡ0, MgΡ1 and MgΡ2 of the ribosomal stalk and to explore the role of Protein Kinase CK2 and Superoxide Dismutase in the activity of these P-proteins, which is crucial in the regulation of gene expression during translation. The eukaryotic ribosomal stalk, a pentameric protuberance of P0(P1)2(P2)2 proteins, interacts with the elongation factor EF-2 and plays an important role in the regulation of protein synthesis. P0 protein seems to be overexpressed in cancer an ...
περισσότερα

Όλα τα τεκμήρια στο ΕΑΔΔ προστατεύονται από πνευματικά δικαιώματα.

DOI
10.12681/eadd/28851
Διεύθυνση Handle
http://hdl.handle.net/10442/hedi/28851
ND
28851
Εναλλακτικός τίτλος
Molecular study of the genes of ribosomal stalk proteins, superoxide dismutase and protein kinase CK2 in the mussel Mytilus galloprovincialis
Συγγραφέας
Κολαΐτη, Ρεγγίνα-Μαρία (Πατρώνυμο: Σωτήριος)
Ημερομηνία
2010
Ίδρυμα
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (ΕΚΠΑ). Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Βιολογίας. Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας
Εξεταστική επιτροπή
Κουγιανού-Κουτσούκου Σοφία
Τύπας Μιλτιάδης
Κομητοπούλου Αικατερίνη
Φραγκούλης Εμμανουήλ
Szyszka Ryszard
Γαϊτανάκη Αικατερίνη
Αλεπόρου-Μαρίνου Βασιλική
Επιστημονικό πεδίο
Φυσικές Επιστήμες
Βιολογία
Λέξεις-κλειδιά
Μύδια; Ριβοσωμικός μίσχος; Ριβοσωμικές πρωτεΐνες; Φωσφορυλίωση; Υπεροξειδικη δισμουτάση; Πρωτεϊνική κινάση; Περιβαλλοντική καταπόνηση
Χώρα
Ελλάδα
Γλώσσα
Ελληνικά
Άλλα στοιχεία
xiii, 228 σ., πιν., σχημ.