Ανάπτυξη και αξιολόγηση πειραματικού συστήματος κυτταρικής ανοσοθεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών

Abstract

T cell-based adoptive immunotherapy is a promising approach for the therapy of patients with advanced epithelial ovarian cancer (EOC). However, adoptive T cell therapy currently requires the isolation and characterization of rare antigen-specific T cells from each patient thus limiting its broad application. However, large amounts of tumor-reactive T cells with redirected specificity toward tumor associated antigens (TAA) can be generated following their genetic engineering with: A. Antigen-specific T cell receptors (TCRs) that bind to endogenously processed antigen-derived peptides that are presented by the major histocompatibility complex (MHC) molecules. B. Chimeric antigen receptors (CARs) that couple the high affinity binding of antibodies with the signaling domains of the T cell receptor and can bind to extracellular antigens in a non-MHC dependent manner.Ovarian cancers express a variety of TAA. Amongst those antigens ErbB2 (HER2/neu) represents an attractive candidate for the immunotherapy of cancer patients. However, the breadth of ErbB2 expression by primary human ovarian cancers remains controversial, which questions the suitability of this antigen for T cell based therapies. To address this issue, we performed extensive ErbB2 expression analysis on a wide panel of primary tumors as well as established and short-term human ovarian cancer cell lines. Sensitive detection methods including flow cytometry, western blot analysis and q-PCR revealed ErbB2 expression in all fresh tumor cells derived from primary ascites or solid tumors as well as all established cancer cell lines.In order to develop T cell immunotherapeutic strategies against ErbB2-expressing tumors we isolated a novel ErbB2-specific TCR from highly avid ErbB2-specific CD8+ T cells. T cells genetically modified to express the ErbB2 TCR recognized some ovarian tumor cell lines that efficiently processed and presented the ErbB2 peptide 369-377 through their MHC class I molecules (HLA-A2). In order to improve the targeting of ErbB2-expressing ovarian cancer and we sought toemploy CAR T cell therapy. Genetically-engineered human T cells expressing an ErbB2-specific chimeric antigen receptor (CAR) recognized and reacted against all established or primary ovarian cancer cells.For the development of immunotherapeutic approaches against other tumor antigens we constructed and evaluated a fully-human CAR with specificity for mesothelin which is widely expressed in EOC. Primary human T cells expressing the P4 CAR specifically produced exerted potent cytolytic functions when co-cultured with mesothelin-expressing tumors in vitro. Of note P4 CAR reactivity was not abrogated by soluble tumor-secreted or recombinant mesothelin protein even at supraphysiological levels. Importantly, adoptive transfer of P4 CAR-expressing T cells mediated the regression of large, established tumor in a xenogenic model of human ovarian cancer.A caveat of the P4 CAR approach is the possible on-target toxicity in normal mesothelial tissues that express low levels of mesothelin. To specify T cells for robust effector function that is selective for tumor but not normal tissue, we developed a trans-signaling CAR strategy that employs two CARs of differing antigen specificity; one recognizing mesothelin and the other the folate receptor alpha (FRα). T cells were simultaneously transduced with a CAR that provides suboptimal activation upon binding of mesothelin and a chimeric costimulatory receptor that recognizes a FRα. Trans-signaling CAR T cells demonstrated strong reactivity only against tumor cells co-expressing both antigens. Only weak reactivity was observed against mesothelin-expressing target cells both in vitro and in vivo. Thus, a dual specificity, trans-signaling CAR approach can potentiate the therapeutic efficacy of CAR T cells against cancer while minimizing "on target " toxicity against normal tissues bearing a single antigen.In summary, we have successfully constructed, developed and characterized physiological (TCR) and chimeric antigen receptors (CAR) of human origin. Finally to retain the powerful capacity of a conventional CAR T cell approach and increase the safety of the CAR T cells we developed a novel trans signaling CAR T cell platform. The above mentioned T cell engineering strategies will improve the anti-cancer effectiveness of T cell adoptive transfer therapies and inaugurate avenues for the successful treatment of ovarian cancer.

Η μεταφορά αυτόλογων Τ λεμφοκυττάρων που έχουν υψηλή ικανότητα αναγνώρισης και δραστικότητας κατά συγκεκριμένων αντιγόνων του καρκίνου των ωοθηκών αποτελεί μια ισχυρή θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Ένας περιοριστικός παράγοντας στις τρέχουσες ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν μηχανισμούς καταστολής της ανοσολογικής επιτήρησης τους. Έτσι τα Τ κύτταρα που έχουν υψηλή ειδικότητα και δραστικότητα κατά διαφόρων καρκινικών αντιγόνων απουσιάζουν από τους όγκους των ωοθηκών. Με στόχο την δημιουργία Τ κυττάρων με ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα προχωρήσαμε στη γενετική τροποποίηση Τ κυττάρων με: Α. Φυσιολογικούς Τ κυτταρικούς υποδοχείς (TCRs) με ειδικότητα για καρκινικά πεπτίδια προσδεδεμένα σε MHC μόρια τάξεως Ι. Β. Χιμαιρικούς Τ ανοσοϋποδοχείς (CARs) οι οποίοι αναγνωρίζουν εξωκυττάριες πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων ανεξάρτητα από την έκφραση των MHC μορίων.Τα ωοθηκικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν ένα πλήθος αντιγόνων τα οποία είναι στενά συνδεδεμένα με την εξέλιξη και την επιθετικότητα του όγκου. Ένα από τα ελκυστικότερα αντιγόνα-στόχους είναι το ErbB2 (HER2/neu). Το εύρος όμως της έκφρασης αυτού του υποδοχέα στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων παραμένει αμφισβητούμενο. Γι' αυτό το λόγο πραγματοποιήσαμε εκτενή ανάλυση της έκφρασης του ErbB2 σε ένα μεγάλο αριθμό πρωτογενών όγκων και καρκινικών σειρών. Με εφαρμογή πιο ευαίσθητων μεθόδων ανίχνευσης και ανάλυσης, όπως είναι η κυτταρομετρία ροής, η ανοσοαποτύπωση και η ποσοτική PCR αποδείξαμε την ευρεία έκφραση του ErbB2 σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που προήλθαν από πρωτοπαθείς στερεούς όγκους και ασκίτες καθώς επίσης και από ωοθηκικές καρκινικές σειρές.Για τη στόχευση του υποδοχέα του ErbB2 κλωνοποιήσαμε ένα καινοτόμο Τ κυτταρικό υποδοχέα με ειδικότητα για τον ErbB2 επίτοπο 369-377 από ErbB2-ειδικά Τ κύτταρα. Γενετικά τροποποιημένα Τ κύτταρα που εξέφραζαν τον ανασυνδυασμένο ErbB2-ειδικό Τ κυτταρικό υποδοχέα αντέδρασαν κατά ορισμένων καρκινικών σειρών Οι συγκεκριμένες σειρές παρουσιάζαν σε επαρκή ποσότητα τον ErbB2 αντιγονικό επιτόπο 369-377 με μόρια MHC τάξεως I (HLA-A2) πάνω στην κυτταρική επιφάνεια. Αντιθέτως, γενετικά τροποποιημένα Τ κύτταρα που εξέφραζαν ένα ErbB2-χιμαιρικό ανοσοϋποδοχέα αντέδρασαν κατά όλων των πρωτοπαθών καρκινικών κυττάρων και καρκινικών σειρών με επακόλουθο την έκκριση κυτταροκινών και τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων.Για την ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών προσέγγισεων έναντι άλλων αντιγόνων κατασκευάσαμε έναν χιμαιρικό ανοσοϋποδοχέα (P4) με ειδικότητα για τη μεσοθηλίνη η οποία εκφράζεται ευρέως στον καρκίνο των ωοθηκών. T κύτταρα που είχαν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να εκφράζουν το P4 χιμαιρικό ανοσουποδοχέα παρουσίασαν ισχυρή δραστικότητα κατά καρκινών κυττάρων που εκφράζουν μεσοθηλίνη και ικανότητα εξολόθρευσης συμπαγών όγκων in vivo. Επίσης βρήκαμε ότι η ενεργότητα των P4 CAR Τ κυττάρων δεν επηρεάστηκε από τα υψηλά επίπεδα μεσοθηλίνης που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα.Λόγω του χαμηλού αλλά ανιχνεύσιμου επιπέδου έκφρασης της μεσοθηλίνης στα φυσιολογικά μεσοθηλιακά κύτταρα, η ασφάλεια της χρήσης γενετικά τροποποιημένων P4 Τ κυττάρων εγκυμονεί τον κίνδυνο καταστροφής φυσιολογικών ιστών. Με στόχο την αύξηση της επιλεκτικότητας των T κυττάρων έναντι των καρκινικών κυττάρων αναπτύξαμε μια καινοτόμο πλατφόρμα γενετικής τροποποίησης αυτών με δύο χιμαιρικούς ανοσοϋποδοχείς ειδικότητας για τα καρκινικά αντιγόνα μεσοθηλίνη και υποδοχέα του φυλλικού οξέος (FRα). Για τηπλήρη λειτουργία αυτών των Τ κυττάρων πρέπει να υπάρχει δυνατότητα ταυτόχρονης πρόσδεσης και των δύο υποδοχέων στους αντιγονικούς τους στόχους. Τα διπλής ειδικότητας T κύτταρα παρουσιάσαν ισχυρή δραστικότητα μόνο κατά καρκινικών κύτταρων τα οποία εκφράζουν και τις δύο πρωτεΐνες. Αντιθέτως, τα Τ αυτά κύτταρα επέδειξαν δραματικά μειωμένο βαθμό λειτουργιών έναντι κυττάρων που εξέφραζαν μόνο μεσοθηλίνη. Συνεπώς η στρατηγική αυτή καθιστά δυνατή την αποτελεσματική εξολόθρευση καρκινικών κυττάρων και την ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης στόχευσης φυσιολογικών ιστών.Ανακεφαλαιώνοντας, στη παρούσα διατριβή περιγράψαμε την ανάπτυξη και δοκιμή διαφόρων προσεγγίσεων με τις οποίες μπορούν να δημιουργηθούν Τ κύτταρα με ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Τέλος για την ασφαλή εφαρμογή αυτών των προσεγγίσεων σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές με ασθενείς καρκίνου των ωοθηκών αναπτύξαμε μια μέθοδο για την ελαχιστοποίηση της Τ κυτταρικής δραστικότητας κατά των φυσιολογικών ιστών.