Development and validation of protocols for virus, viroid and phytoplasma detection to be used for the certification of pome fruit propagation material

Abstract

Virus and virus-like diseases of pome fruits are being systematically studied by researchers since the 60s, as it was realized that they are responsible for significant economic losses. Pome fruits are propagated by grafting or budding and as viruses, viroids and phytoplasmas are graft-transmissible agents, they are inadvertently spread during this procedure. So far, there are no official diagnostic protocols available for the detection of the majority of common virus and virus-like agents of pome fruits. Additionally, with the wide application of high-throughput sequencing (HTS) technology, new viruses and viroids infecting pome fruits are continuously discovered, with in most cases unknown impact to their hosts. In this context, the first goal of the present study was the development of validated diagnostic protocols, based on modern molecular techniques, for the detection of important viruses, viroids and phytoplasmas of pome fruits. Furthermore, it was aimed to update previously obtained data on the occurrence and prevalence of known viruses and viroids in Greek pome fruit orchards as well as to study their genetic diversity and thus, also test the efficiency of the designed protocols to detect all isolates. Finally, last goal was to identify recently discovered or putative novel viruses and viroids of pome fruits in Greek orchards by designing molecular assays based on HTS obtained genomic sequences along with sequences so far available in public databases. In order to accomplish the above-mentioned goals, two assays of probe-based reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) were developed for the simultaneous single-step one-tube detection of three targets. The first assay detected simultaneously apple stem pitting virus, apple stem grooving virus and apple mosaic virus whilst the second detected apple scar skin viroid, pear blister canker viroid and universally the phytoplasmas. To overcome high genetic variability, shorter probes were designed incorporating minor groove binder (MGB) moiety at 3’ end, which provably increases their sequence specificity at elevated hybridization temperatures. The assays were combined with CTAB nucleic acids extraction protocols, optimized for multiplex detection and validated for sensitivity, specificity and reproducibility. Limits of detection were defined and comparative analyses showed that the multiplex assays were 10–100 times more sensitive than conventional protocols. Both assays displayed high sensitivity, efficiency and reliability in detecting major pome tree pathogens with either RNA or DNA genome. Surveys were then conducted in three major apple producing areas in Greece –Tegea in Peloponnese, Agia and Zagora in Thessaly- and samples were collected from trees showing viral disease symptoms and from asymptomatic trees as well. All samples were tested with the herein developed protocols which, with their improved sensitivity compared to previously used assays, contributed new data relevant to the occurrence of associated pathogens in Greek orchards. RNA from selected samples of each region were pooled and subjected to HTS. Bioinformatic analysis of the HTS data provided for the first time, nearly complete genome sequences of Greek isolates of major apple viruses thus offering information on their genomic variability and phylogenetic relationships. Designed primers and probes were in silico tested against these genomic sequences. Furthermore, the presence of recently discovered viruses and viroids (apple rubbery wood virus 1 and 2, citrus concave gum-associated virus, apple luteovirus 1, apple hammerhead viroid) along with a putative novel Cytorhabdovirus was revealed by HTS analysis and confirmed by herein developed conventional RT-PCR assays followed by Sanger sequencing. All collected samples were tested for the presence of those new viruses and viroid in order to estimate their occurrence in Greek orchards. Differences in the richness of apple virome among three apple-producing regions of Greece, as those were revealed by HTS analysis, were associated to the use or not of certified propagation material and the age of the trees. The present study improves substantially our knowledge on apple virome in Greece and provides a handful of diagnostic protocols for sensitive and reliable detection of major pome fruit viruses, viroids and phytoplasmas along with those recently discovered, that can be used for testing and certifying plant propagation material aiming to sustainable pome fruit tree production.

Ήδη από τη δεκαετία του 60 η έρευνα για τις ιώσεις και τις συναφείς με αυτές ασθένειες των γιγαρτόκαρπων είχε αρχίσει να συστηματοποιείται καθώς γίνονταν αντιληπτές οι σημαντικές οικονομικές απώλειες που προκαλούν. Τα γιγαρτόκαρπα πολλαπλασιάζονται με εμβολιασμό της επιθυμητής ποικιλίας σε κατάλληλο υποκείμενο. Καθώς οι ιοί, τα ιοειδή και τα φυτοπλάσματα που τα προσβάλλουν είναι εμβολιο-μεταδιδόμενα, διασπείρονται και μεταφέρονται ακούσια με το πολλαπλασιαστικό υλικό. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επίσημα διαγνωστικά πρωτόκολλα για τα περισσότερα από αυτά τα παθογόνα ενώ παράλληλα, με την ολοένα και ευρύτερη εφαρμογή της αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High-Throughput Seguencing, HTS), ανακαλύπτονται διαρκώς νέοι ιοί και ιοειδή που πιθανόν να σχετίζονται με ασθένειες των γιγαρτόκαρπων. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν αρχικά να αναπτυχθούν διαγνωστικά πρωτόκολλα, βασισμένα σε σύγχρονες μοριακές τεχνικές, για τους πιο κοινούς ιούς, ιοειδή και φυτοπλάσματα που προσβάλλουν τα γιγαρτόκαρπα, ώστε να εφαρμοστούν κατά τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού. Παράλληλα, στόχος ήταν η εν μέρει επικαιροποίηση των δεδομένων για τη διασπορά και τη συχνότητα εμφάνισης των γνωστών ιών και ιοειδών που απαντώνται στις καλλιέργειες γιγαρτόκαρπων της Ελλάδας αλλά και η μελέτη της γενετικής ποικιλομορφίας τους. Τέλος, επιδιώχθηκε η διαπίστωση της ύπαρξης τυχόν νέων ιών και ιοειδών των γιγαρτόκαρπων στην Ελλάδα και η ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσής τους. Για την πραγματοποίηση των στόχων της εργασίας, έγινε σχεδιασμός δύο δοκιμών, αντίστροφης μεταγραφής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-qPCR) με ιχνηλάτες για την ταυτόχρονη ανίχνευση τριών στόχων σε ένα δείγμα με μία αντίδραση. H πρώτη δοκιμή αναπτύχθηκε για την ταυτόχρονη ανίχνευση των ιών της βοθρίωσης του ξύλου της μηλιάς (apple stem pitting virus), του αυλακωτού ξύλου της μηλιάς (apple stem grooving virus) και του μωσαϊκού της μηλιάς (apple mosaic virus), και η δεύτερη για τα ιοειδή της εσχάρωσης του φλοιού των μήλων (apple scar skin viroid), του εξανθηματικού έλκους της αχλαδιάς (pear blister canker viroid) και καθολικά των φυτοπλάσματων. Λόγω της υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας, σχεδιάστηκαν μικρότερου μήκους ιχνηλάτες στους οποίους συζεύχθηκαν μόρια που προσδένονται στην ελάσσονα αύλακα του DNA (minor groove binder, MGB) και τα οποία προσδίδουν τη δυνατότητα αποτελεσματικού και εξειδικευμένου υβριδισμού του ιχνηλάτη στο στόχο σε υψηλές θερμοκρασίες. Οι μέθοδοι συνδυάστηκαν με πρωτόκολλα εξαγωγής ολικών νουκλεϊκών οξέων βασιζόμενα στην τασιενεργό ουσία CTAB, ακολούθησε βελτιστοποίηση των συνθηκών των αντιδράσεων για πολλαπλή, ταυτόχρονη ενίσχυση των στόχων καθώς και δοκιμές για την ευαισθησία, εξειδίκευση και επαναληψιμότητά τους. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και έγινε σύγκριση με συμβατικές μεθόδους, η οποία έδειξε 10-100 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία των νέων δοκιμών. Και τα δύο πρωτόκολλα παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία, αποτελεσματικότητα και αξιοπιστία στην ανίχνευση των κυριότερων ιών και συναφών παθογόνων των γιγαρτοκάρπων, είτε αυτά διέθεταν RNA είτε DNA γονιδίωμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επισκόπηση καλλιεργειών μηλιάς σε τρεις διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας – στην Τεγέα, η οποία ανήκει στην περιφερειακή ενότητα Αρκαδίας στην Πελοπόννησο, και στην Αγιά και τη Ζαγορά της περιφέρειας Θεσσαλίας– για συλλογή δειγμάτων με συμπτώματα ιώσεων ή και ασυμπτωματικών. Τα δείγματα ελέγχθηκαν με τα νέα πρωτόκολλα και η αυξημένη ευαισθησία τους συνέβαλε στην επικαιροποίηση των δεδομένων από προηγούμενες έρευνες για τη συχνότητα εμφάνισης και διάδοσης του κάθε ιού στην Ελλάδα. Επιλεγμένα δείγματα αναλύθηκαν κατά ομάδες με εφαρμογή της HTS. Από την βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων, προέκυψαν για πρώτη φορά σχεδόν πλήρεις αλληλουχίες του γονιδιώματος ελληνικών απομονώσεων των κυριότερων ιών οι οποίες επιβεβαίωσαν και in silico την αποτελεσματικότητα των ολιγονουκλεοτιδίων που σχεδιάστηκαν ενώ πραγματοποιήθηκαν και φυλογενετικές αναλύσεις. Επίσης, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία τεσσάρων πρόσφατα ανακαλυφθέντων ιών και ενός ιοειδούς στις μηλιές (apple rubbery wood virus 1 και 2, citrus concave gum-associated virus, apple luteovirus 1, apple hammerhead viroid) αλλά και ενός πιθανολογούμενου νέου ιού του γένους Cytorhabdovirus. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της HTS, αναπτύχθηκαν συμβατικές RT-PCR και ακολούθησε αλληλούχηση Sanger. Ο έλεγχος όλων των δειγμάτων για αυτά τα παθογόνα έδωσε μια ενδεικτική πρώτη εκτίμηση της διασποράς τους στους οπωρώνες. Το ιολογικό φορτίο (ίωμα) της μηλιάς στις τρεις διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας παρουσίασε διαφορές ως προς τον πλούτο της σύνθεσής του οι οποίες αντικατοπτρίζουν τη χρήση ή όχι πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού και την ηλικία των οπωρώνων της κάθε περιοχής. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μία πρώτη λεπτομερή καταγραφή του ιώματος της μηλιάς στην Ελλάδα και προσφέρει ένα περιεκτικό σύνολο διαγνωστικών πρωτοκόλλων για την ανίχνευση των σημαντικότερων γνωστών αλλά και των προσφάτως ανακαλυφθέντων ιών, ιοειδών και φυτοπλασμάτων των γιγαρτόκαρπων, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον έλεγχο και την πιστοποίηση του πολλαπλασιαστικού υλικού γιγαρτόκαρπων με στόχο έναν υγιέστερο και βιώσιμο οπωρώνα.