Μελέτη του ρόλου του NF-κB στην απόπτωση κυττάρων που εκτίθενται σε παράγοντες οξειδωτικού στρες και σε κυτταροκίνες

Abstract

NF-κB is a redox sensitive transcription factor, however, its activation and its role in human lung tumor cells in response to oxidative stress remains elusive. Here, we addressed the role of NF-κB signaling in H₂O₂ or VP-16 treatment human lung tumor epithelial cells A549. To this end we genetically manipulated the NF-κB signaling pathways either using a super repressor of NF-κB, IκBαSR, or by knocking down its activating IKK kinases, IKKα and IKKβ. First, we showed that treatment of A549 cells with H₂O₂ or VP-16 resulted in the accumulation of endogenous reactive oxygen species, initiated a DNA damage checkpoint response leading to inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis, only after treatment with H₂O₂, dose-dependently. H₂O₂ and VP-16 treatment had differential effects on the expression of proteins involved in the regulation of cell cycle progression cyclin D1 and Cdc6, f E2F1 and p53-p21Cip/Waf1 axis. Also, H₂O₂ treatment, but not VP-16, induced apoptosis, which was accompanied by a reduction in Bcl-2 expression, conformational changes of Bax, activation of caspase-3 and nuclear accumulation of proteolyticaly cleaved form of PARP-1. H₂O₂, but not VP-16, stimulated the nuclear translocation and accumulation of IKKα, but not of IKKβ, and of IκBα and in addition mediated the phosphorylation of cytoplasmic IκBα, dose-dependently. Nuclear translocation of IKKα correlated with the phosphorylation of histone H3 at serine 10. Further, H₂O₂ mediated the phosphorylation of p65 and nuclear translocation of p-p65 and stimulated NF-κB transcriptional activity and VP-16 mediated the phosphorylation of p65 and nuclear translocation of both p65 and p-p65. While forced overexpression of NF-κB super repressor, IηBαSR, altered the expression of cell cycle regulatory proteins and sensitized A549 cells to H₂O₂-mediated apoptosis, constitutive activation of NF-κB, using a constitutively active IKKβ T-loop mutant IKKβca suppressed H₂O₂-mediated apoptosis. Importantly, while knocking-down IKKβ-mediated canonical NF-κB signaling sensitized A549 cells to H₂O₂-mediated early and late apoptosis, ablation of IKKα produced, mainly, evidence of late apoptosis. These data suggested that both H₂O₂ and VP-16 activated NF-κB, but H₂O₂ through IKKα-mediated phosphorylation of RelA/p65 and VP-16 through the canonical pathway and that interfering with NF-κB signaling pathways sensitized tumor cells to apoptosis. In addition, we showed that both H₂O₂ and VP16 effected differentially the expression of the replication licensing factor, Cdc6. Our data suggested that the IκΒ kinase α (ΙΚΚα) plays a major role in the regulation of Cdc6.

Ο ΝF-κB είναι ένας οξειδοαναγωγικά ευαίσθητος μεταγραφικός παράγοντας ωστόσο η ενεργοποίησή του και ο ρόλος του στα ανθρώπινα πνευμονικά κύτταρα, ως απόκριση στο οξειδωτικό στρες, παραμένει ασαφής. Στη μελέτη αυτή διερευνήσαμε το ρόλο της σηματοδότησης ΝF-κB, ύστερα από τη χορήγηση H₂O₂ ή VP-16 σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Για το σκοπό αυτό χειραγωγήσαμε γενετικά τα μονοπάτια ενεργοποίησης του ΝF-κB είτε χρησιμοποιώντας έναν υπέρ-καταστολέα του ΝF-κB, τον ΙκBαSR, η αποσιωπώντας τις ενεργοποιητικές IKK κινάσες, τις ΙΚΚα και ΙΚΚβ. Αρχικά, δείξαμε πως η χορήγηση H₂O₂ ή VP-16 στα κύτταρα Α549 είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση των ενδογενών δραστικών μορφών οξυγόνου, εκκίνησε μια απόκριση σε βλάβες στο DNA οδηγώντας στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επαγωγής της απόπτωσης, μόνο μετά τη χορήγηση H₂O₂, δόσο-εξαρτώμενα. Η χορήγηση H₂O₂ και VP-16 είχε διαφορετικές επιδράσεις στην έκφραση πρωτεϊνών, που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κυκλίνη D1 και Cdc6, E2F1 και του άξονα p53-p21 Cip/Waf1. Επίσης η χορήγηση H₂O₂, αλλά όχι VP-16, επήγαγε την απόπτωση, η οποία συνοδεύτηκε από μείωση της έκφρασης της Bcl-2, αύξηση της έκφρασης της Bax, ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και πυρηνική συσσώρευση της πρωτεολυτικά διασπασμένης PARP-1. Η χορήγηση H₂O₂, αλλά όχι VP-16, διέγειρε την πυρηνική μετατόπιση και συσσώρευση της ΙΚΚα, αλλά όχι και της ΙΚΚβ, και της ΙκΒα και επιπρόσθετα επήγαγε τη φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής ΙκΒα, δόσο-εξαρτώμενα. Η πυρηνική μετατόπιση της ΙΚΚα συσχετίστηκε με τη φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 στη σερίνη10. Επιπλέον το H₂O₂ επήγαγε τη φωσφορυλίωση της p65 και την πυρηνική μετατόπιση της p-p65 και διέγειρε τη μεταγραφική δραστικότητα του NF-κΒ, ενώ η χορήγηση VP-16 επήγαγε τη φωσφορυλίωση της p65 και την πυρηνική μετατόπιση τόσο της p65 όσο και της p-p65. Ενόσω η επιβαλλομένη υπέρ-έκφραση του υπέρ καταστολέα του NF-κΒ, IκBαSR, μετέβαλλε την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και ευαισθητοποίησε τα κύτταρα Α549 στην επαγόμενη από το H₂O₂ απόπτωση, η ιδιοσυστατική ενεργοποίηση του NF-κΒ, με τη χρήση μιας ιδιοσυστατικά ενεργής ΙΚΚβ με μεταλλαγμένο Τ-βρόγχο, ΙΚΚβca, κατέστειλε την επαγόμενη από το H₂O₂ απόπτωση, Ακόμα, η αποσιώπηση της ΙΚΚβ, άρα η καταστολή της κανονικής πορείας ενεργοποίησης του NF-κΒ, ευαισθητοποίησε τα κύτταρα στην επαγόμενη από το H₂O₂ πρώιμη και όψιμη απόπτωση, ενώ η αποσιώπηση της ΙΚΚα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της όψιμης απόπτωσης στα κύτταρα Α549. Τα δεδομένα προτείνουν πως τόσο το H₂O₂ όσο και το VP-16 ενεργοποίησαν τον NF-κΒ, αλλά το H₂O₂ μέσω φωσφορυλίωσης της RelA/p65 από την ΙΚΚα και το VP-16 μέσω της κανονικής πορείας ενεργοποίησης του NF-κΒ και πως η καταστολή των πορειών ενεργοποίησης του NF-κΒ ευαισθητοποίησε τα κύτταρα Α549 στην επαγόμενη από το H₂O₂ απόπτωση. Επιπρόσθετα, δείξαμε πως η χορήγηση H₂O₂ και VP-16 επηρεάζουν διαφορετικά την έκφραση του αδειοδοτικού παράγοντα για την αντιγραφή, Cdc6. Τα δεδομένα μας προτείνουν πως η κινάση ΙΚΚα παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης της Cdc6.