Βιολογία και γενετική του δάκου της ελιάς με κλασικές και σύγχρονες προσεγγίσεις

Abstract

Olive tree cultivation comprises an important factor of the agricultural economy of many countries, especially those around the Mediterranean basin, where 98% of the global olive tree crops are located. Bactrocera oleae is the main enemy of olive trees and is considered to be of great economic interest since it causes both a great loss in olive production and a reduction of the quality of the olive oil. Limiting the spreading of the wild populations of B. oleae has been the target of many studies both on an experimental level and on the level of field applications. Several treatment methods have been proposed, including the use of the natural enemies of the insect, such as Bacillus thuringiensis, and the release of sterilized B.oleae stocks in nature. Nevertheless, the main method used even nowadays is based on the extensive use of chemical pesticides, which comes with such implications as the destruction of the environment, the deterioration of human health and the degradation of product quality. A spherical knowledge on the biology of the insect is considered a necessary step in order to develop more effective control methods. The aim of the present study is the investigation of the biology and a genetic approach of B. oleae in three levels of study. The first level of study includes the application of Geographic Information Systems as a means to describe the population dynamic of B.oleae. Spatial and temporal distribution analysis of the insect was performed around the town of Ormilia in the Chalkidiki region during 2005. The collected data (a network of 700 Mcphail traps, number of captures, climatic data, geographic limits of the study area) were georeferenced and transformed in digital databases. The databases were uploaded in the Geographic Information Systems and Local Spatial Statistics was applied. The statistical analysis allowed the identification of areas with high or low insect density. Moreover, the population dynamic of the insect was linked with data, such as the anaglyph and the microclimate of the area. The second level of study focuses on the genetic structure of wild populations from ten different regions of Greece, by analyzing the polytene complement of the insect. Analyses showed that the banding pattern of all chromosomes is similar between the wild and the lab strains, and it is the same among individuals of the same population and among individuals of all distant populations that were studied. Furthermore, no inversions, translocations or deletions were detected. The only chromosome abnormalities that were detected both in the lab strain and all the wild strains were successive inverse duplications in specific chromosomal positions. This analysis has concluded that the genome of the olive fruit fly has been evolutionary preserved to a large extent. The next level of study focuses on the symbiotic flora of the insect. Detection and identification of bacteria in all available populations was performed. The study includes both traditional approaches, such as classic microbiology, and modern ones, such as molecular biology and the use of confocal microscopy. The presence of bacteria in the laboratory strain was confirmed by the use of universal bacterial primers. The presence of the Gram-positive bacteria Enterococcus faecalis and Paenibacillus glucanolyticus and of the Gram-negative Acetobacter tropicalis in the laboratory strain was shown by constructing 16S rRNA libraries. The dominant bacterium in the laboratory population was Acetobacter tropicalis. The result was confirmed for all developmental stages of the lab strain and for all available wild strains as well. Isolation, cultivation and sequencing of 16S rRNA gene and phylogenetic analysis of A. tropicalis followed. Moreover, the tissue distribution and the biological role of A. tropicalis were investigated by recolonizing larvae and adults B. oleae with transformed bacteria (A. tropicalis BA1.3-Gfp). The specialization of the symbiotic relationship between B. oleae και A. tropicalis was investigated by co-feeding larvae of B.oleae and D.melanogaster with two different transformed bacteria (A. tropicalis BA1.3-Gfp και Escherichia coli DH5α pKan-DsRed). Detection, cultivation, and transformability, along with the easy cultivability and capability to colonize the insect body make Acetobacter tropicalis a promising candidate in the development of a Symbiotic Control approach.

Η καλλιέργεια της ελιάς αποτελεί σημαντικό παράγοντα της αγροτικής οικονομίας για πολλές χώρες, κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου, όπου εντοπίζεται το 98% των καλλιεργούμενων ελαιόδεντρων σε παγκόσμιο επίπεδο. Το έντομο Bactrocera oleae είναι ο κυριότερος εχθρός της ελιάς και θεωρείται ως ένα από τα έντομα μεγάλης οικονομικής σημασίας, δεδομένου ότι προκαλεί μεγάλες απώλειες στην ελαιοπαραγωγή και υποβάθμιση της ποιότητας του ελαιόλαδου. Η καταπολέμηση και ο περιορισμός της εξάπλωσης του εντόμου αποτέλεσε και συνεχίζει να αποτελεί αντικείμενο ερευνών τόσο σε πειραματικό όσο και σε επίπεδο εφαρμογών στο πεδίο. Διάφορες μέθοδοι αντιμετώπισης έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένης της χρήσης φυσικών εχθρών του δάκου, της χρήσης στελεχών Bacillus thuringiensis καθώς και της απελευθέρωσης στο πεδίο στείρων στελεχών του εντόμου. Η κύρια, ωστόσο, μέθοδος καταπολέμησης, που εφαρμόζεται μέχρι σήμερα, βασίζεται στην ευρεία χρήση χημικών εντομοκτόνων με ό,τι αυτό συνεπάγεται στη μόλυνση του περιβάλλοντος, στην επιβάρυνση της υγείας του ανθρώπου αλλά και στην υποβάθμιση της ποιότητας του προϊόντος. Βασική ωστόσο προϋπόθεση για την αποτελεσματικότητα εφαρμογής οποιασδήποτε μεθόδου ελέγχου του δάκου είναι η πληρέστερη εικόνα της βιολογίας του εντόμου. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της βιολογίας και της γενετικής του εντόμου B. oleae σε τρία επίπεδα μελέτης: Στο πρώτο επίπεδο γίνεται εφαρμογή των Γεωγραφικών Συστημάτων Πληροφοριών στη μελέτη της δυναμικής πληθυσμών του εντόμου B.oleae. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση της χωρικής και χρονικής κατανομής του εντόμου σε περιοχή αποκλειστικής καλλιέργειας ελιάς, νοτιανατολικά της πόλης Ορμύλια του νομού Χαλκιδικής για το έτος 2005. Τα δεδομένα (δίκτυο 700 παγίδων MCphail, αριθμός συλλήψεων, κλιματολογικά δεδομένα, όρια περιοχής μελέτης) γεωαναφέρθηκαν και στη συνέχεια μετατράπηκαν σε ψηφιακές βάσεις δεδομένων. Οι βάσεις δεδομένων εισήχθησαν στο περιβάλλον των Γεωγραφικών .Συστημάτων Πληροφοριών όπου εφαρμόσθηκε η μεθοδολογία της Τοπικής Χωρικής Στατιστικής. Η ανάλυση επέτρεψε τον εντοπισμό περιοχών με υψηλή και χαμηλή πυκνότητα πληθυσμών καθώς και ουδέτερων ζωνών. Ταυτόχρονα, η δυναμική του εντόμου συσχετίσθηκε με δεδομένα όπως το ανάγλυφο και το μικροκλίμα της περιοχής. Το δεύτερο επίπεδο περιλαμβάνει τη μελέτη της γενετικής σύστασης φυσικών πληθυσμών δάκου από 10 διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας, με ανάλυση του προτύπου των ζωνώσεων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων. Η ανάλυση έδειξε ότι το ζωνικό πρότυπο όλων των χρωμοσωμάτων του δάκου παρουσιάζεται όμοιο με εκείνο του εργαστηριακού πληθυσμού και παραμένει σταθερό τόσο μέσα στα άτομα του ίδιου πληθυσμού, όσο και μεταξύ των ατόμων όλων των απομακρυσμένων πληθυσμών, που μελετήθηκαν. Επιπλέον, στα πολυταινικά χρωμοσώματα του εντόμου δεν ανιχνεύθηκαν ελλείμματα, αναστροφές και μετατοπίσεις χρωμοσωματικών τμημάτων. Οι μόνες χρωμοσωματικές αναδιατάξεις, που παρατηρήθηκαν τόσο στον εργαστηριακό πληθυσμό όσο και στο σύνολο των φυσικών πληθυσμών είναι η παρουσία ανάστροφων διαδοχικών διπλασιασμών σε συγκεκριμένες χρωμοσωματικές θέσεις. Συνολικά, ανιχνεύθηκαν εννέα ανάστροφοι διαδοχικοί διπλασιασμοί. Ή ανάλυση του ζωνικού προτύπου των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των 10 φυσικών πληθυσμών δάκου έδειξε ότι το γονιδίωμα του B. oleae είναι πολύ συντηρημένο. Το επόμενο επίπεδο εστιάζεται στη μελέτη των συμβιωτικών μικροοργανισμών του εντόμου. Έγινε έλεγχος της παρουσίας βακτηρίων και χαρακτηρισμός των βακτηρίων του εντόμου, τόσο του εργαστηριακού όσο και όλων των διαθέσιμων φυσικών πληθυσμών. Η μελέτη περιλαμβάνει τόσο παραδοσιακές προσεγγίσεις, όπως η κλασική μικροβιολογία όσο και σύγχρονες, όπως η μοριακή βιολογία και η χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας. Αρχικά επιβεβαιώθηκε η παρουσία βακτηρίων στο εργαστηριακό στέλεχος του εντόμου με τη χρήση παγκόσμιων βακτηριακών εκκινητών. Με την κατασκευή 16S rRNA βιβλιοθηκών αναδείχθηκε η παρουσία τόσο Gram-θετικών βακτηρίων Enterococcus faecalis και Paenibacillus glucanolyticus όσο και Gram-αρνητικών Acetobacter tropicalis. Η κυρίαρχη ωστόσο συμβιωτική βακτηριακή μορφή στο εργαστηριακό πληθυσμό δάκου βρέθηκε να είναι αυτή του Acetobacter tropicalis. Το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε για όλα τα αναπτυξιακά στάδια του εργαστηριακού πληθυσμού αλλά και για το σύνολο των διαθέσιμων φυσικών πληθυσμών. Ακολούθησε απομόνωση και καλλιέργεια του A.tropicalis σε κατάλληλα θρεπτικά μέσα, πλήρης αλληλούχιση του 16S rRNA γονιδίου και φυλογενετική ανάλυση σε σύγκριση με ήδη γνωστά βακτηριακά στελέχη του γένους Acetobacter. Παράλληλα διερευνήθηκε η ιστική κατανομή και ο βιολογικός ρόλος του A. tropicalis, με πειράματα αποικισμού προνυμφών και ενήλικων B. oleae με μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος (A. tropicalis BA1.3-Gfp). Από τη άλλη, μελετήθηκε η εξειδίκευση της συμβιωτικής σχέσης B. oleae και A. tropicalis με ταυτόχρονη χορήγηση δυο μετασχηματισμένων βακτηριακών στελεχών (A. tropicalis BA1.3-Gfp και Escherichia coli DH5α pKan-DsRed), τόσο σε προνύμφες B. oleae, όσο και σε προνύμφες D. melanogaster. Η ανίχνευση, η καλλιέργεια σε τεχνητά θρεπτικά υποστρώματα, η δυνατότητα μετασχηματισμού και ο επαναποικισμός του A.tropicalis, το καθιστά υποψήφιο για μεθόδους βιολογικού ελέγχου του εντόμου.