Ανάλυση πληθυσμών του σημαντικότερου παράσιτου της ελιάς, του εντόμου Bactrocera oleae με χρήση μοριακών δεικτών

Abstract

The olive fruit fly is the major pest of the olive trees. If untreated, more than 30% of the annual oil production is lost due to the parasitism of the olive fruits. The insect is found mainly in the Mediterranean basin where 98% of the olive trees are grown. In 1998 the first detectionof the insect took place in Los Angeles of California and within the next five years the fly spread in all olive-growing areas of the State. In the present study, a few key issues of the fly’s invasion in California were addressed: a) the analysis of the genetic structure of the olive fruit fly population, b) the determination of the ​​origin of the biological invasion and c) thepossibility of multiple invasion events in the area. Theseissues were addressed through the genetic comparison ofCalifornia olive fruit fly diachronic collections (from 1999to 2009) with Mediterranean populations of a previousanalysis, based on the use of ten microsatellite markers. That analysis (Augustinos et al., 2005) on one handhad revealed the existence of three distinct Mediterranean subpopulations - that of eastern, central and western populations - and on the other hand had indicated awestward expansion of the insect on the European sideof the Mediterranean basin. The present analysis showedthat the Californian olive fruit fly population is fairly homogeneous and distinct from the rest of the Mediterranean subpopulations. However, the data also revealed agenetic relatedness between the Californian populationand the subpopulation from the eastern Mediterraneanbasin, which consequently identifies as the most likelygeographic area of the ​​origin of the biological invasion.Additionally, the analysis indicates the possibility of a second incident of biological invasion, located geographicallyin the area of ​​San Luis Obispo and temporally in 2004 to2006. Furthermore, a population analysis based on threemitochondrial molecular markers (cytochrome oxidase I,cytochrome oxidase II and 12S ribosomal RNA) was alsoperformed. In this analysis, three additional samples wereincorporated, one from southern and two from north-western Africa, which broadened the geographic base ofthe analysis. Results were in agreement with the findingsof the microsatellite analysis. Moreover, the data showedan evolutionary relationship between olive fly populations of South Africa and the eastern Mediterranean and,in addition, that the westward expansion of the insect inthe European side of the basin (previously reported byAugustinos) continued towards the north-west Africasince the Strait of Gibraltar does not seem to be an insurmountable geographic barrier.In parallel, there was an attempt to understand the extent of genetic adaptation to artificial mass rearing conditions. Beyond the theoretical importance of such ananalysis, there is also a practical interest of creating massreared robust laboratory strains for field releases, in thecontext of control efforts through the application of theSterile Insect Technique (SIT). In this part of the presentthesis, genetic changes that occurred in the course of 22generations during a colonization process of an israelipopulation were analysed. The monitoring of fluctuatinggenotypic frequencies of ten microsatellite loci showedthe halving of the average values of​​ the actual and effective number of alleles and heterozygosity in 11 laboratory generations. Very little genetic change was detectedin the first two laboratory generations, while substantialgenetic changes occurred between generations F 2 andF 5 . After generation F 8 a period of an intensive adaptiveprocess followed, which peaked in the F 11 generation andmaintained almost constant until the F 22 generation. Tothe extent that robustness of a laboratory strain is closelyrelated to the level of polymorphism, an enrichment program of the colonized strain with wild biological material,approximately every 8 generations, would be sufficient toretain the wild character of the strain in case of re-introduction into natural ecosystems. Additionally, two different approaches based on different simulation models indicated that most of the observed adaptive evolutionarychanges were due to random genetic drift, since evidencefor the presence of selective forces was identified in onlyone microsatellite locus.

Ο δάκος της ελιάς αποτελεί το βασικότερο εχθρό της. Η ετήσια μείωση της ελαιοπαραγωγής που προκαλείτο συγκεκριμένο παράσιτο μπορεί να φθάσει έως και το 30%. Το έντομο απαντάται κυρίως στη λεκάνη της Μεσογείου όπου φύεται το 98% των ελαιοδένδρων. Το1998 εντοπίστηκαν για πρώτη φορά ενήλικα δάκου στο Λος Άντζελες της Καλιφόρνιας και μέσα στα επόμενα πέντε έτη το έντομο εξαπλώθηκε σε όλες τις ζώνες ελαιοκαλλιέργειας της Πολιτείας. Στο πλαίσιο αυτής της διδακτορικής διατριβής έγινε προσπάθεια: α) ανάλυσης της γενετικής δομής του πληθυσμού του εντόμου στην Καλιφόρνια, β) καθορισμού της περιοχής προέλευσης της εισβολής και γ) διερεύνησης του εάν η παρουσία του δάκου στην Καλιφόρνια είναι το αποτέλεσμα ενός ή περισσοτέρων συμβάντων βιολογικής εισβολής. Για τους λόγους αυτούς πραγματοποιήθηκε γενετική σύγκριση μεταξύ διαχρονικών συλλογών δάκου από την Καλιφόρνια (της περιόδου 1999-2009) και μεσογειακών δειγμάτων προηγούμενης πληθυσμιακής ανάλυσης με τη χρήση μικροδορυφορικών δεικτών. Προηγούμενες μελέτες (από τον Αυγουστίνο και τους συνεργάτες το 2005) είχαν αποκαλύψει αφενός την ύπαρξη τριών μεσογειακών υποπληθυσμών - της ανατολικής, της κεντρικής και της δυτικής της Μεσογείου - και αφετέρου την προς δυσμάς εξάπλωση του δάκου προς την ευρωπαϊκή πλευρά της μεσογειακής λεκάνης. Από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προέκυψε ότι ο πληθυσμός του δάκου στην Καλιφόρνια δεν φαίνεται να παρουσιάζει κάποια ιδιαίτερη εσωτερική γενετική διαφοροποίηση και επίσης ότι είναι αρκετά διακριτός αφού διαφοροποιείται γενετικά από όλους τους υπόλοιπους μεσογειακούς υποπληθυσμούς. Κυρίως, όμως, η παρούσα διατριβή αποκάλυψε μία γενετική σύνδεση μεταξύ του πληθυσμού της Καλιφόρνιας και του υποπληθυσμού από την ανατολική πλευρά της Μεσογείου, η οποία τελικά προσδιορίζεται ως η πλέον πιθανή περιοχή προέλευσης της εισβολής. Επιπρόσθετα, ανέκυψαν ενδείξεις που υποστηρίζουν την πιθανότητα ενός δεύτερου συμβάντος βιολογικής εισβολής, που εντοπίζεται γεωγραφικά στην περιοχή του San Luis Obispo και χρονικά τη διετία2004-2006. Τα ίδια ερωτήματα προσεγγίστηκαν και με την ανάλυση τριών δεικτών του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του δάκου, προερχόμενων από τις περιοχές που κωδικοποιούν για το ένζυμο «κυτοχρωμική οξειδάση Ι», το ένζυμο «κυτοχρωμική οξειδάση ΙΙ» και γιατο 12S ριβοσωμικό RNA αντίστοιχα. Η συγκεκριμένη ανάλυση συμπεριέλαβε και τρία επιπλέον δείγματα από τη νότια και τη βορειοδυτική Αφρική τα οποία διεύρυναν γεωγραφικά τη βάση της. Τα συμπεράσματα της τελευταίας ανάλυσης έρχονται σε μία καταρχήν συμφωνία με αυτά της μικροδορυφορικής. Επιπλέον, από την ανάλυση προκύπτει αφενός ότι οι πληθυσμοί δάκου της νότιας αφρικανικής πλευράς φαίνεται να έχουν μια εξελικτική σχέση με τους πληθυσμούς της ανατολικής Μεσογείου, και αφετέρου ότι η προς τα δυτικά εξάπλωση του εντόμου στη βόρεια πλευρά της μεσογειακής λεκάνης (που είχε αρχικά αναφερθεί από την ερευνητική εργασία του Αυγουστίνου) συνεχίστηκε προς την πλευρά της βορειοδυτικής Αφρικής, αφού τα στενά του Γιβραλτάρ δεν φαίνεται να στάθηκαν ανυπέρβλητο γεωγραφικό εμπόδιο. Παράλληλα, έγινε μία προσπάθεια κατανόησης της γενετικής προσαρμογής του εντόμου σε τεχνητές συνθήκες μαζικής εκτροφής. Πέρα από τη θεωρητική σημασία μιας τέτοιας ανάλυσης, υπάρχει και το πρακτικό ενδιαφέρον της δημιουργίας εύρωστων εργαστηριακών στελεχών μαζικής παραγωγής για εξαπολύσεις στη φύση, στο πλαίσιο προσπαθειών ελέγχου μέσω της τεχνικής του στείρου εντόμου (SIT: Sterile Insect Technique). Στο συγκεκριμένο σκέλος της παρούσας διατριβής αναλύθηκαν οι γενετικές μεταβολές που έλαβαν χώρα κατά τη διαδικασία αποικιοποίησης ενός φυσικού πληθυσμού από την ευρύτερη περιοχή του κεντρικού Ισραήλ, μέσα στο χρονικό πλαίσιο 22γενεών. Η μελέτη των γονοτυπικών συχνοτήτων δέκα μικροδορυφορικών γενετικών δεικτών υπέδειξε τον υποδιπλασιασμό των μέσων τιμών τριών δεικτών πολυμορφισμού (του πραγματικού και δραστικού αριθμού αλληλομόρφων και της ετεροζυγωτίας) μέσα σε 11 εργαστηριακές γενεές. Στις δύο πρώτες εργαστηριακές γενεές εντοπίστηκαν ελάχιστες γενετικές αλλαγές, ενώ αντίθετα μεταξύ των γενεών F 2 και F 5 καταγράφηκαν σημαντικές. Από την F 8 γενεά και μετέπειτα ακολούθησε μία περίοδος μεγαλύτερης προσαρμοστικής έντασης, η οποία κορυφώθηκε στην F 11 γενεά όπου και διατηρήθηκε σχεδόν αμετάβλητη έως και την F 22 γενεά. Στο βαθμό που η ευρωστία ενός εργαστηριακού στελέχους είναι συνάρτηση του επιπέδου πολυμορφισμού του, ένα πρόγραμμα εμπλουτισμού του αποικιοποιημένου στελέχους με αγρίου τύπου βιολογικό υλικό περίπου κάθε 8 γενεές θα ήταν αρκετό για να διατηρήσει το στέλεχος περισσότερο ανταγωνιστικό σε περίπτωση επαναεισαγωγής του στα φυσικά οικοσυστήματα. Τέλος, δύο διαφορετικές προσεγγίσεις βασιζόμενες σε διαφορετικά προσομοιωτικά μοντέλα έδειξαν ότι το μεγαλύτερο μέρος των παρατηρούμενων προσαρμοστικών αλλαγών αποδίδεται στην τυχαία γενετική παρέκκλιση, αφού ένδειξη για άσκηση επιλογικών δυνάμεων εμφανίστηκε σε ένα μόνο μικροδορυφορικό γενετικό τόπο.