Μοριακή ανάλυση της δομής και της οργάνωσης του γονιδιώματος του σημαντικότερου παράσιτου της ελιάς, του εντόμου Bactrocera oleae

Abstract

The olive fruit fly, Bactrocera oleae, causesextensive damages in olive production. Apart fromits great economic importance, little information isavailable at the genetic and molecular level.Genomic analysis of this insect is important not onlywith regard its basic research, but also due tofurther implications in biological control methods.Effective application of such methods, like theSterile Insect Technique (S.I.T.), relies on theavailability of fundamental genetic and moleculardata. Consequently, the analysis of B. oleae’sgenome structure may contribute towards thedevelopment of basic knowledge and tools for thisinsect.In the context of the present analysis, the B.oleae’s genome size was determined through aquantitative Real-time PCR approach. Genome sizewas estimated at about 3.22 x 108bp, which places itat the lower end of the dipteran genome size range.The isolation and characterization of 195selected cDNA clones was also achieved. Thesequence determination of these ESTs allowedfurther comparisons with known protein sequencesdeposited in the database and consequently thecorresponding genes were characterized. Inaddition, based on D. melanogaster matches, theESTs were functionally assigned and classified withGene Ontology terms, allowing a primary estimationof the insect’s transcriptome organization accordingto the ESTs’ distribution to each functional category.Moreover, the exact cytogenetic localization of35 EST clones was determined by in situhybridization to the insect’s polytene chromosomes,enriching the available physical map with more thandouble entry points.Additionally, it the synteny between B. oleaeand D. melanogaster was also explored, firstly bydemonstrating the colinearity of the chromosomalsegments between the two species and secondly bythe examination of the respective chromosomalpositions among the mapped ESTs and theirDrosophila orthologs. As a consequence, a syntenymap of the two species was produced, enabling alsothe identification of some syntenic blocks.Taking advantage of the availability of thesenew sequences, the overall codon frequencies ofthe active transcriptome were calculated, in orderto examine the presence of a conserved profile. Thecomparative sequence analysis of the B. oleae ESTswith the homologous D. melanogaster genes led tothe development of 17 nuclear EPIC-PCR markers(Exon Priming Intron Crossing-PCR). These markerswere used for the amplification of thecorresponding intron sequences in 11 Tephritids,which were subsequently used for phylogeneticcomparisons.Additionally, with the use of a segment of aputative LTR retrotransposon (named Achilles) as aprobe, a B. oleae genomic library was screened andseveral phage clones were analyzed in order toisolate an intact copy of the retrotransposon.Molecular and in silico analysis of the isolated clonesled to the clarification of the B. oleae’s LTRretrotransposon Achilles organization, according tothe respective structure of the homologous elementMAX of D. melanogaster, which belongs to the BELPaofamily. More specifically, the Achilles sequencewas determined at about 7,487 bp, consisting of the5’ LTR end, the 5’ non coding sequence and theopen reading frame (ORF) which encodes thepolyprotein gag-pol. In a quantitative Real-time PCRapproach the element’s copies were calculated atabout 42 copies per genome. Moreover the activityof the element was examined, demonstrating thepresence of at least one active copy of Achilles inthe genome.During the analysis of Achilles containing phageclones, a conserved centromeric satellite sequenceof about ~ 300 bp was also discovered. This tandemrepeat, named BoR300, was species specific, asdetermined by Southern analysis on several relatedspecies. This finding can render it a speciesdiagnostic marker, particularly of themorphologically indistinguishable larval and pupalstages of several closely related species of the Tephritidae family. Finally, BOR300 was estimatedto occupy ~ 0.3 % of the insect’s genome, whereasthe examination of its distribution on polytene andmitotic B. oleae choromosomes enabled the firstcorrelation between these two types ofchromosomes, concerning 2 out of the sixautosomes.

Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, προκαλεί τημεγαλύτερη ποιοτική και ποσοτική ζημία στηνελαιοπαραγωγή. Παρά την οικονομική τουσημασία, ελάχιστες πληροφορίες είναι διαθέσιμεςσε μοριακό και γενετικό επίπεδο. Η γονιδιωματικήανάλυση του εντόμου, πέρα από τη σημασία τηςστη βασική έρευνα του δάκου, έχει και προεκτάσειςσε μεθόδους βιολογικού ελέγχου του εντόμου,όπως η μέθοδος του στείρου εντόμου (Sterile InsectTechnique, SIT) οι οποίες προαπαιτούν την ύπαρξηβασικών μοριακών και γενετικών δεδομένων.Συνεπώς, η ανάλυση της οργάνωσης τουγονιδιώματος του δάκου δύναται να συνεισφέρειπρος την κατεύθυνση ανάπτυξης βασικών γνώσεωνκαι εργαλείων για το έντομο αυτό.Στα πλαίσια της παρούσας ανάλυσης,προσδιορίστηκε το μέγεθος του γονιδιώματος τουδάκου μέσω Real-time PCR. Το μέγεθος τουγονιδιώματος είναι περίπου 3.22 x 108 bp, γεγονόςπου το κατατάσσει στο κάτω εύρος της κλίμακαςτων γνωστών μεγεθών των Διπτέρων.Επιτεύχθηκε επίσης η απομόνωση και ηταυτοποίηση 195 κλωνοποιημένων αλληλουχιώντης cDNA βιβλιοθήκης του δάκου. Ο καθορισμόςτης αλληλουχίας αυτών των EST δεικτών έδωσε τηδυνατότητα σύγκρισής τους με άλλες ήδη γνωστέςπρωτεϊνικές αλληλουχίες των βάσεων δεδομένων,με αποτέλεσμα να εκτιμηθεί η λειτουργία τωναντίστοιχων γονιδίων. Επιπλέον, βάσει τηςομολογίας των ΕSTs με γονίδια της Drosophilamelanogaster πραγματοποιήθηκε ηκατηγοριοποίησή τους με όρους γονιδιακήςοντολογίας (Gene Ontology) καθιστώντας εφικτήμια δυνητική εκτίμηση της οργάνωσης τουτρανσκριπτόματος του εντόμου σύμφωνα με τηνκατανομή των ΕSTs σε κάθε κατηγορία.Παράλληλα, για 35 από αυτούς τους τυχαίουςEST κλώνους προσδιορίστηκε με in situ υβριδισμό ηκυτταρογενετική θέση τους στα πολυταινικάχρωμοσώματα του εντόμου, εμπλουτίζοντας τονκυτταρογενετικό χάρτη του δάκου καθώς πλέονδιπλασιάζονται τα σημεία εισόδου στο γονιδίωμα.Παράλληλα διερευνήθηκε η συνταινιακότητα τουδάκου με τη D. melanogaster, καθορίζοντας κατ’αρχήν την ομολογία των χρωμοσωμικών στουςστοιχείων και κατά δεύτερον τις ομολογίες τωνγονιδίων τους όσον αφορά τη διάταξή τους στουςκυτταρογενετικούς χάρτες. Αποτέλεσμα τηςσύγκρισης αυτής ήταν η δημιουργία τουαντίστοιχου χάρτη συνταινιακότητας μεταξύ τωνδύο οργανισμών και παράλληλα η ταυτοποίησηορισμένων συνταινιακών περιοχών. Αξιοποιώνταςτη διαθεσιμότητα των νέων αλληλουχιώνυπολογίστηκε και η συχνότητα επιλογής τωνσυνώνυμων κωδικονίων κατά την μεταγραφικήδραστηριότητα και περαιτέρω ελέχθηκε η ύπαρξησυντηρημένου προφίλ συγκριτικά με άλλουςοργανισμούς. Η συγκριτική ανάλυση τηςαλληλουχίας EST δεικτών του δάκου με τουςαντίστοιχους γενετικούς τόπους στη D.melanogaster έδωσε επίσης τη δυνατότητασχεδιασμού 17 ζευγών εκκινητών για την ενίσχυσηπαρεμβαλλομένων ιντρονίων (Exon Priming IntronCrossing-PCR), τη δια-ειδική εφαρμογή τους σεάλλα 11 είδη της οικογένειας Tephritidae καιακολούθως τη φυλογενετική τους σύγκριση.Επιπλέον με τη χρήση ενός πιθανολογούμενουτμήματος ρετρομεταθετού στοιχείου(επονομαζόμενου Achilles) ως ανιχνευτή,αναλύθηκαν φαγικοί κλώνοι μέσω διαλογής τηςγονιδιωματικής λ βιβλιοθήκης του εντόμου για τηναπομόνωση ενός ακέραιου αντιγράφου τουρετρομεταθετού. Η μοριακή ανάλυση των κλώνωνπου απομονώθηκαν και η in silico επεξεργασίατους, οδήγησαν στη διαλεύκανση της οργάνωσηςτου LTR ρετρομεταθετού Achilles του δάκουσύμφωνα με την αντίστοιχη δομή του ομόλογουστοιχείου ΜΑΧ της D. melanogaster, που ανήκειστην οικογένεια BEL-Pao. Συγκεκριμέναπροσδιορίστηκε συνολικά η αλληλουχία 7,487 bpπου περιλαμβάνει το 5’ LTR άκρο, την αλληλουχίατης 5΄ μη κωδικής περιοχής που ακολουθεί και τοπλήρες αναγνωστικό πλαίσιο που κωδικοποιεί τηνπολυπρωτεΐνη gag-pol του ρετρομεταθετούστοιχείου Achilles, ενώ με ποσοτική Real-time PCRκαθορίστηκε ότι ο αριθμός των συνολικών του αντιγράφων στο γονιδίωμα αντιστοιχεί σε 42.Επιπλέον διερευνήθηκε η ενεργότητα τουστοιχείου, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότιδυνητικά εντοπίζεται τουλάχιστον ένα ενεργόαντίγραφο του Achilles στο γονιδίωμα.Παράλληλα, κατά τη διαδικασία αναζήτησης τουμεταθετού Achilles, αποκαλύφθηκε η ύπαρξη μιαςσυντηρημένης κεντρομερικής δορυφορικήςαλληλουχίας ~300 bp. Το επαναλαμβανόμενο αυτόστοιχείο, που ονομάστηκε BoR300, χαρακτηρίστηκεως ειδικό για το δάκο, όπως αποδείχτηκε μετά απόχρήση του σε αναλύσεις κατά Southern και άλλωνσυγγενικών του ειδών, γεγονός που το συνιστάέναν ανιχνευτή είδους, που θα μπορούσε νακαταστεί ιδιαίτερα χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείοστην αναγνώριση ατόμων του εντόμου, κατά τοαναπτυξιακό στάδιο της προνύμφης ή της νύμφης,στο οποίο είναι δύσκολη η διάκριση από άλλασυγγενικά του είδη Tephritidae. Πέρα από τατυπικά χαρακτηριστικά του, καθορίστηκε επιπλέονη συμμετοχή του στη δομή του γονιδιώματος ίση μεκατά προσέγγιση ~ 0.3%, ενώ ο έλεγχος τηςκατανομής του στα πολυταινικά και μιτωτικάχρωμοσώματα του εντόμου, έδωσε τη δυνατότητατης πρώτης συσχέτισης μεταξύ των δύο τύπωνχρωμοσωμάτων.