Φυτοπαθολογική και μοριακή διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην άμυνα των φυτών κατά των παθογόνων των αδρομυκώσεων

Abstract

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην άμυνα των φυτών εναντίον των μυκήτων που προκαλούν αδρομυκώσεις, Verticillium dahliae και Fusarium oxysporum. Κατά τη διαδικασία της αναγνώρισης και της μόλυνσης των φυτών από τα παθογόνα έχει αναφερθεί η συμμετοχή του σαλικυλικού οξέος (SA), του ιασμονικού οξέος (JA) και του αιθυλενίου (ET), καθώς και των μονοπατιών πρόσληψης και μεταγωγής του σήματός τους στα φυτά. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το αιθυλένιο και το μονοπάτι μεταγωγής του σήματός του συμμετέχουν στην άμυνα των φυτών εναντίον διαφόρων παθογόνων και ιδιαίτερα των νεκροτροφικών. Σε ορισμένες περιπτώσεις διαπιστώθηκε ότι η μη αντίληψη του αιθυλενίου προάγει την ασθένεια που προκαλούν τα παθογόνα ενώ σε άλλες φάνηκε ότι τα φυτά δεν παρουσίασαν τόσο έντονα συμπτώματα όσο τα φυτά αγρίου τύπου. Πάντως, σε καμία περίπτωση τα μειωμένα συμπτώματα δεν συσχετίστηκαν με τη μειωμένη ποσότητα των παθογόνων στους ιστούς των φυτών, υποδεικνύοντας ότι η μη αντίληψη του αιθυλενίου δεν ενεργοποιεί την καταστολή της ανάπτυξης των παθογόνων αλλά είναι μια αντίδραση που σχετίζεται κυρίως με τη φυσιολογία των φυτών. Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκαν πειράματα παθογένειας με τους μύκητες V. dahliae και F. oxysporum σε μια σειρά μεταλλαγμένων και γενετικώς τροποποιημένων φυτών Arabidopsis thaliana στα μονοπάτια του SA, του JA και του ET έτσι ώστε να μελετηθεί ο ρόλος τους στην άμυνα των φυτών κατά των αδρομυκώσεων. Διαπιστώθηκε ότι μόνο τα μεταλλαγμένα φυτά etr1-1, στα οποία o υποδοχέας αιθυλενίου ETR1 είναι απενεργοποιημένος, παρουσίασαν στατιστικά λιγότερο έντονα συμπτώματα και χαμηλότερο ποσοστό ασθένειας μετά τη μόλυνσή τους με τους μύκητες V. dahliae και F. oxysporum σε σχέση με όλα τα υπόλοιπα μεταλλαγμένα φυτά που χρησιμοποιήθηκαν. Για να διερευνηθεί αν η μείωση αυτή οφείλεται σε μειωμένη ανάπτυξη των παθογόνων στους αγγειακούς ιστούς των φυτών etr1-1, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ποσοτικοποίησης των μυκήτων σε φυτά αγρίου τύπου και στα μεταλλαγμένα φυτά του αιθυλενίου, με αντιδράσεις Realtime PCR σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά την μόλυνση τους με τους μύκητες. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η ποσότητα των παθογόνων στα etr1-1 φυτά ήταν σημαντικά μικρότερη από τα υπόλοιπα μεταλλαγμένα φυτά υποδεικνύοντας ότι αναπτύσσεται κάποιος μηχανισμός που περιορίζει τα παθογόνα στους ξενιστές αυτούς. Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός αυτός, μελετήθηκε το μεταγραφικό προφίλ των φυτών etr1-1 σε σχέση με αυτό των αγρίου τύπου φυτών 6 ημέρες μετά τη μόλυνση τους με τον μύκητα V. dahliae με τη βοήθεια της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών (microarrays). Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού έδειξαν ότι 95 γονίδια υπερεκφράστηκαν τουλάχιστον δύο φορές μόνο στα etr1-1 φυτά και από αυτά επιλέχθηκε μια ομάδα από εννέα γονίδια ως υποψήφια για επιβεβαίωση με Real-time PCR σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά τη μόλυνση με τον V. dahliae. Σε αυτά τα πειράματα συμπεριλήφθηκαν 23 ακόμα γονίδια που αποτελούν δείκτες επαγωγής αμυντικών μηχανισμών μέσω των μονοπατιών αντίληψης του αιθυλενίου, του σαλικυλικού, του ιασμονικού και του αμπσισικού οξέος. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της Real-time PCR επιβεβαίωσαν την υπερέκφραση των γονιδίων GSTF12, GSTU16 (glutathione-S-transferases), CHI-1, CHI-2 (chitinases), PR-5 (thaumatin-like), PR-1, PR-2 (β-1,2 glucanase) και του μεταγραφικού παράγοντα Myb75 στα etr1-1 φυτά σε σχέση με τα αγρίου τύπου και ein4 φυτά καθ’ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, υποδεικνύοντας τη μοριακή βάση που ελέγχει την ανθεκτικότητα στον μύκητα V. dahliae. Ακολούθως για να διερευνηθεί εάν η πρόσληψη του αιθυλενίου παίζει αντίστοιχο ρόλο στην άμυνα φυτών τομάτας εναντίον του μύκητα V. dahliae πραγματοποιήθηκαν πειράματα παθογένειας του μύκητα με τα μεταλλαγμένα φυτά Never ripe (Nr), που έχουν απενεργοποιημένο τον υποδοχέα αιθυλενίου LeETR3, ο οποίος είναι ομόλογος του ETR1 του φυτού A. thaliana. Διαπιστώθηκε ότι τα μεταλλαγμένα φυτά Nr παρουσίασαν στατιστικά λιγότερα συμπτώματα από τα φυτά αγρίου τύπου. Τα πειράματα ποσοτικοποίησης που ακολούθησαν έδειξαν ότι στα Nr φυτά η ποσότητα του μύκητα ήταν σημαντικά μικρότερη σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου. Επίσης διερευνήθηκε η δυνατότητα επαγωγής RNA γονιδιακής σίγησης, μέσω της τεχνολογίας της ιïκά επαγόμενης γονιδιακής σίγησης (virus induced gene silencing – VIGS), ώστε να επιτευχθεί μείωση της έκφρασης του γονιδίου ETR4 που κωδικοποιεί έναν άλλο υποδοχέα αιθυλενίου στη τομάτα. Μετά την επίτευξη της γονιδιακής σίγησης του ETR4 ακολούθησαν δοκιμές παθογένειας με τον μύκητα V. dahliae όπου βρέθηκε ότι τα φυτά που είχαν υποστεί σίγηση παρουσίασαν λιγότερα συμπτώματα από τα φυτά του μάρτυρα. Σε αυτή την περίπτωση δεν παρατηρήθηκε διαφοροποίηση της ποσότητας του V. dahliae στα φυτά που είχαν υποστεί σίγηση σε σχέση με τα φυτά του μάρτυρα, τουλάχιστον τη χρονική στιγμή (τέλος πειράματος 37 ημέρες μετά τη μόλυνση) που πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα ποσοτικοποίησης. Η εργασία αυτή έδειξε το σημαντικό ρόλο των υποδοχέων ETR1 και Nr στις αδρομυκώσεις υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της λειτουργίας τους οδηγεί στην ενεργοποίηση μηχανισμών άμυνας των φυτών που περιορίζουν τα παθογόνα. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας συνεισφέρουν σε ένα βαθμό στη κατανόηση της αλληλεπίδρασης των φυτών με τα παθογόνα των αδρομυκώσεων, που είναι απαραίτητη ώστε να αναπτυχθούν αποτελεσματικοί τρόποι αντιμετώπισης τους, αφού μέχρι σήμερα η καταπολέμηση τους δεν είναι αποτελεσματική.