Μελέτη των μορφολογικών και ποιοτικών αλλαγών στον καρπό εμβολιασμένων φυτών κολοκυθιού με ολιστικές τεχνολογίες

Abstract

Fruits are essential for the human diet as they provide important vitamins, minerals and soluble dietary fibre. The genetic basis of fruit size and shape was investigated for the first time in vegetables and genes associated with fruit morphology have been identified. Although extensive genomic resources are available at present for tomato, cucumber, melon and watermelon, genomic databases for Cucurbita species are limited. In the current study we used these databases to perform comparative transcriptome analysis in order to identify genes with potential roles in fruit morphology and fruit size. Differential Gene Expression (DGE) analysis between cv. ‘Munchkin’ (small-fruit) and cv. ‘Big Moose’ (large-fruit) revealed a variety of candidate genes associated with fruit morphology showing significant differences in gene expression between the two cultivars. In addition, we have generated EST-SSR markers, which discriminate different C. pepo cultivars and show transferability to related Cucurbitaceae species. In the last few years, a growing number of investigations in Cucurbitaceae and Solanaceae grafting aimed at improving horticultural crop performance in terms of fruit yield and quality. Nevertheless, studies concerning the effect of grafting on fruit morphology, nutritional value, fruit size and shape in particular, are scarce. To further understand, the impact of grafting on fruits and to comprehend mechanisms involved in the graft-induced changes we studied homo- and reciprocally hetero- grafted Cucurbita pepo cultivars (cv.) with vary in fruit size and shape. In this direction, C. pepo cv. ‘Munchkin’ (small fruit) and cv. ‘Big Moose’ (large fruit) as well as cv. ‘Round green’ (round fruit) and cv. ‘Princess’ (elongated fruit) were homografted and reciprocally heterografted. The results shown, by comparison to homo-grafting, significant changes in fruit size when ‘Big Moose’ scion was hetero-grafted onto ‘Munchkin’ rootstocks. While moderate changes in fruit shape were observed when both reciprocal grafting combinations of cv. ‘Round green’ and cv. ‘Princess’ were performed. This is the first report of such phenotypic changes after intra-species/inter-cultivar grafting in Cucurbitaceae. Additionally, we reveal significant changes i) in secondary metabolite profile, ii) in global DNA methylation and iii) in miRNA expression patterns in grafted scions and in DNA methylation and miRNAs on graft-induced fruit morphology changes. The results of the present study will contribute to further understanding the molecular mechanisms regulating fruit morphology and to identifying the factors that determine fruit size. Moreover, they may lead to the development of molecular marker tools for selecting genotypes with desired morphological traits. Our results contribute to understanding of the graft-induced effects on fruit architecture in intra-species grafting as well. They pave the way for understanding the role of phenolic metabolites and epigenetic molecular mechanisms, like DNA methylation and miRNAs, in the phenotypic changes recorded.

Οι καρποί των λαχανικών είναι απαραίτητοι για την ανθρώπινη διατροφή, καθώς παρέχουν σημαντικές βιταμίνες, μέταλλα και διαλυτές φυτικές ίνες που αναβαθμίζουν την ποιότητα τους. Λόγω της υψηλής παραλλακτικότητας που διέπει το κολοκύθι, οι καρποί του ποικίλουν σε σχήμα, μέγεθος και ποιοτικά χαρακτηριστικά. Η γενετική βάση του μεγέθους και του σχήματος των καρπών στα φυτά διερευνήθηκε για πρώτη φορά στα λαχανικά και ταυτοποιήθηκαν τα γονίδια που συνδεόνται με τη μορφολογία των καρπών. Σήμερα υπάρχουν πολλές βάσεις δεδομένων που παρέχουν πληροφορίες για το γονιδίωμα της τομάτας, του αγγουριού, του πεπονιού και του αγγουριού, σε αντίθεση με τις διαθέσιμες βάσεις δεδομένων για το κολοκύθι που είναι περιορισμένες. Στην παρούσα μελέτη δημιουργήθηκε μια βάση δεδομένων για 2 ποικιλίες του είδους Cucurbita pepo με εξαιρετικά διαφορετικό μέγεθος καρπού (ποικιλία ‘Munchkin’ (μικρόκαρπη) και ποικιλία ‘Big Moose’ (μεγαλόκαρπη)), με τη χρήση της τεχνολογίας της αλληλούχησης του μεταγραφήματος (RNA-seq). Με τη χρήση αυτής της βάσης δεδομένων πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση των μεταγραφημάτων των δύο ποικιλιών κολοκυθιού προκειμένου να προσδιοριστούν τα γονίδια που έχουν πιθανό ρόλο στη μορφολογία του καρπού. Η ανάλυση DGE αποκάλυψε μια ποικιλία υποψήφιων γονιδίων που σχετίζονται με τη μορφολογία του καρπού με σημαντικές διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των δύο υπό μελέτη ποικιλιών. Επιπλέον, δημιουργήθηκαν 13 μοριακοί δείκτες EST-SSR, που έχουν την δυνατότητα να διαχωρίζουν διαφορετικές ποικιλίες του είδους C. pepo ενώ 6 μοριακοί δείκτες EST-SSR μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στα συγγενή είδη της οικογένειας Cucurbitaceae. Τα τελευταία χρόνια, παράγεται ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός ερευνών του εμβολιασμού στις οικογένειες Cucurbitaceae και Solanaceae με στόχο τη βελτίωση της απόδοσης των καλλιεργειών αλλά και την βελτίωση των ποιοτικών χαρακτηριστικών του καρπού. Παρόλα αυτά, οι μελέτες σχετικά με την επίδραση του εμβολιασμού στη μορφολογία του καρπού και τη θρεπτική αξία στο κολοκύθι, είναι περιορισμένες. Στην παρούσα μελέτη, διευρενήθηκε η επίδραση του εμβολιασμού στην ποιότητα του καρπού σε εμβολιασμένα φυτά 4 ποικιλιών του είδους Cucurbita pepo. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν αυτο-εμβολιασμοί και αμοιβαίοι ετεροεμβολιασμοί των ποικιλιών ‘Munchkin’ (μικρόκαρπη) και ‘Big Moose» (μεγαλόκαρπη), καθώς και ‘Round green’ (στρόγγυλοι καρποί) και ‘Princess’ (επιμήκεις καρποί). Όταν η ποικιλία ‘Big Moose’ χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο, με υποκείμενο την ποικιλία ‘Munchkin’ παρουσιάστηκαν σημαντικές αλλαγές στο μέγεθος καρπού σε σύγκριση με τα αυτόριζα φυτά. Στο σχήμα του καρπού παρατηρήθηκαν μέτριες μεταβολές και στους δύο αμοιβαίους ετερο-εμβολιασμούς των ποικιλιών ‘Round green’ και ‘Princess’ σε σύγκριση με τα αυτόριζα φυτά. Είναι η πρώτη φορά που μελετώνται οι φαινοτυπικές αλλαγές μετά από ενδο-ειδικούς εμβολιασμούς στην οικογένεια Cucurbitaceae. Επιπλέον, μελετήθηκαν οι αλλαγές στην συνολική μεθυλίωση του DNA με τη χρήση των μοριακών δεικτών MSAP όπου παρατηρήθηκαν αυξομειώσεις οι οποίες φαίνεται να εξαρτώνται από την ποικιλία που θα χρησιμοποιηθεί ως υποκείμενο ή εμβόλιο. Επιπρόσθετα, έγινε ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miRNAs των εμβολιασμένων φυτών. Τα εμβολιασμένα φυτά εμφάνισαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης των υπό μελέτη miRNAs σε σύγκριση με τα αυτόριζα φυτά. Τέλος, για την καλύτερη διερεύνηση της ποιότητας των καρπών δημιουργήθηκαν τα μεταβολικά προφίλ των εμβολιασμένων φυτών καθώς και των αυτόριζων φυτών μαρτύρων. Στα δείγματα από τους καρπούς των ποικιλιών του είδους C. pepo με πράσινους καρπούς (ποικιλίες ‘Round green’ και ‘Princess’) και με πορτοκαλί καρπούς (ποικιλίες ‘Big Moose’ και ‘Munchkin’), εντοπίστηκαν 17 και 18 διαφορετικές ενώσεις, αντίστοιχα, οι οποίες διέφεραν στα ποσοστά παρουσίας και συγκέντρωσης. Τα αποτελέσματα αυτά συμβάλουν τόσο την περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη μορφολογία καρπών όσο και στην ανάπτυξη μοριακών δεικτών που θα στοχεύουν στην επιλογή γενοτύπων με επιθυμητά μορφολογικά χαρακτηριστικά. Επίσης ανοίγουν το δρόμο για την καλύτερη κατανόηση των αλλαγών που προκαλούνται λόγω του εμβολιασμού στον φαινότυπο, τους επιγενετικούς μηχανισμούς και το μεταβολικό προφίλ των καρπών του κολοκυθιού.