Επιδημιολογία και αντιμετώπιση του βοτρύτη σε υδροπονική καλλιέργεια μαρουλιού

Abstract

Grey mould, caused by Botrytis cinerea, is one of the major fungal diseases of vegetable crops growing under cover during the winter-early spring period, in Greece. On lettuce, the pathogen usually attacks the base of the plant and eventually leads on basal stem rot and death. For three consecutive years (2010, 2011, 2012) the epidemiological development of B. cinerea was studied on lettuce grown in hydroponics in relation to microclimate and the amount of airborne inoculum. Primary infections were observed 20 days after transplanting: the pathogen invaded the basal stem of the plants via the older, weakened leaves. Infections were increased when the moisture (relative humidity and/or leaf wetness) and airborne inoculum levels were increased for prolonged periods. Temperature was not the main determinant in the development of epidemics. In parallel, the effectiveness of various fungicide spray applications against grey mould was evaluated. Two standard applications were made at seedling stage followed up by one or two more sprays after transplanting, at 15-day intervals. The last application was made at least 4 weeks before harvest. Applications only at seedling stage with Daconil SC (chlorothalonil 50%) 3ml·L-1, Teldor WG (fenhexamid 50%) 1.5g·L-1, Signum WG (boscalid 26.7% + pyraclostrobin 6.7%) 1.5g·L-1, Switch WG (fludioxonil 25% + cyprodinil 37.5%) 0.5g·L-1and Ortiva Οpti SC (azoxystrobin 8% + chlorothalonil 40%) 2.5ml·L-1, reduced significantly the disease incidence and severity, compared to untreated control. The fungicides Switch WG and Signum WG provided the best control, whereas Teldor WG and Daconil SC were less effective. The level of the disease was further reduced with one or two more fungicide applications after transplanting. Fungicides programs were effective despite the predominance of B. cinerea resistant phenotypes in five (QoIRBosRAniRBenHRDicMR) and seven (HydRQoIRBosRAniRPhenRBenHRDicMR) different classes of fungicides, isolated from diseased plants and the glasshouse air. For avoiding the development of resistance, alternative fungicide applications were found necessary. With the exception of applications after transplanting with Daconil SC (chlorothalonil 50%) in all other treatments, no fungicide residues were detected or these were under the European acceptable MRLs, at harvest.The minimum inhibitory concentration (MIC) for spore germination and mycelial growth to nine fungicides of different chemical groups in 100 B. cinerea isolates, was determined in vitro. These concentrations were selected to assess fungicide sensitivity in 818 isolates from lettuce and other vegetable crops, by the use of the point inoculation method. Three phenotypes with multiple resistance to stobilurins (QoI), carboximides (Bos), hydroxyanilides (Hyd), anilinopyrimidines (Ani), phenylpyrroles (Phen), dicarboximides (Dic) and benzimidazoles (Βen), [HydRQoIRBosRAniRPhenMRBenHRDicMR, QoIRBosRAniRBenHRDicMR, QoIRBosRBenHRDicMR] were detected at frequency 7%, 12% and 6%, respectively. These phenotypes were mainly isolated from a glasshouse lettuce crop located in Thessaly. Isolates with single high resistance to benzimidazoles counted 11% in total, and mainly originated from open field lettuce grown in Macedonian or Peloponnesian district. Phenotypes with various resistance combinations (1 to 5 chemical groups) were found in less frequency (<5%). No resistant phenotypes to fluazinam (dinitroanilides) and chlorothalonil (phthalonitriles) were detected. B. cinerea phenotypes exhibiting multiple resistance against seven groups of fungicides, high resistance to fenhexamid (Hyd) and moderate resistance to fludioxonil (Phen), were recorded for the first time in Greece. For reducing grey mould losses the application of anti-resistant strategies is considered necessary.The efficacy of seven fungicides with different mode of action against nine multiple resistant isolates of B. cinerea was tested in situ. The fungicides used were: pyraclostrobin (strobilurins), boscalid (carboxamides), fenhexamid (hydroxyanilides), cyprodinil (anilinopyrimidines), fludioxonil (phenylpyrroles), fluazinam (dinitroanilines) and chlorothalonil (phthalonitriles). Young lettuce leaves (cv. Penelope RZ) immersed in aqueous fungicide suspensions at the recommended spraying concentrations (a.i. %). When the leaves got dried they were placed in Petri dishes with sterilized water agar. Then, inoculations taken place by transferring upside down a 5 mm mycelial disc or a drop of a spore suspension (5x104 mL-1) on the adaxial leaf surface. Fungicide efficacy was evaluated by measuring the size of infection lesion after 3 (mycelium) or 6 (spores) day incubation, respectively, in a growth chamber of 18°C and 10 h lighting. The fungicides pyraclostrobin (0.4 g·L-1) and fenhexamid (1.5 g·L-1) failed to inhibit the development of Botrytis lesion by the resistant isolates, in all tests. Similar results were provided by boscalid (0.8 g·L-1), cyprodinil (0.375 and 0.75 g·L-1) and fludioxonil (0.25 and 0.5 g·L-1) when mycelial discs were used as inoculum. With the exception of one case the fungicides fluazinam (0.4 g·L-1) and chlorothalonil (2.5 g·L-1) were effective against all isolates tested. These results showed the inability of recently introduced fungicides to inhibit the infection by B. cinerea resistant phenotypes obtained from lettuce crops.A novel, high-resolution melting (HRM) analysis was developed to detect single nucleotide polymorphisms associated with resistance to fenhexamid (hydroxyanilides), pyraclostrobin (QoIs), boscalid (SDHIs), carbendazim (benzimidazoles and iprodione (dicarboximides), in B. cinerea isolates. HRM analysis is a PCR based closed-tube method for the detection of DNA sequence variation by demonstrating fluorescence changes in the melting profile of the amplified double stranded DNA amplicon. The identification of the melting curves showed that resistance to fenhexamid was due to a nucleotide change in the erg27 gene, resulting in an amino acid replacement of phenylalanine with valine (58% of the isolates) or serine (42%) at position 412 of the protein. Likewise, in isolates resistant to boscalid, a nucleotide change in the sdhB gene resulted in the replacement of histidine with arginine (78%) or tyrosine (22%) at position 272 of the respective protein. A replacement of glycine with alanine at position 143 of cytochrome b was detected in highly resistant to the QoIs isolates, but not in all cases. In the same amplicon the presence of an extra 1205bp intron was detected in the 43% of the sensitive isolates. Amino acid substitutions E198A and F200Y in BenA gene were associated with high and moderate resistance to carbendazim, respectively. Polymorphism was much stronger in moderately resistant to iprodione isolates where 4 different genotypes were detected in the amplicon: a) I365N (46%), b) I365S (17%), c) Q369P & N373S (17%), d) V368F & Q369H (20%). Additionally, further discrimination of the isolates based on the presence of transposable elements boty and flipper in the genome revealed that 80% of the isolates carried both elements, 15% none and 5% only the boty. Overall, genotyping showed that most multiple resistant phenotypes were characterized by random mutations. However, in some cases there was a significant correlation of some mutations with specific phenotypes. HRM’s comparative advantages over traditional molecular techniques revealed the great potential of this assay in tracking resistance.

Ο βοτρύτης (παθογόνο αίτιο Botrytis cinerea) είναι μία από τις σημαντικότερες ασθένειες των κηπευτικών που καλλιεργούνται σε συνθήκες θερμοκηπίου στην χώρα μας κατά την περίοδο του χειμώνα-αρχές της άνοιξης. Σε καλλιέργεια μαρουλιού το παθογόνο προσβάλει το λαιμό των φυτών με αποτέλεσμα τη σήψη της βάσεως του στελέχους και την αποκοπή της κεφαλής από το ριζικό σύστημα. Για τρία συνεχή χρόνια (2010, 2011, 2012) έγινε μελέτη της επιδημιολογίας του παθογόνου σε μαρούλια υδροπονικής καλλιέργειας με καταγραφή των συνθηκών μικροκλίματος και του εναέριου πληθυσμού. Το παθογόνο εισερχόταν στο λαιμό των φυτών από τα κατώτερα εξασθενημένα φύλλα και προκαλούσε μόλυνση με ορατά συμπτώματα προσβολής 20 ημέρες μετά τη μεταφύτευση. Οι προσβολές ήταν αυξημένες όταν επικρατούσε παρατεταμένη υψηλή υγρασία (σχετική υγρασία, διύγρανση φύλλων) και αυξημένη συγκέντρωση εναερίου μολύσματος ενώ, η θερμοκρασία δεν είχε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη της ασθένειας. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα διαφόρων προγραμμάτων χημικών επεμβάσεων κατά της ασθένειας. Έγιναν δύο ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο σε συνδυασμό με μία ή δύο επιπλέον επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση, ανά 15μερα διαστήματα. Η συγκομιδή έγινε τουλάχιστον 4 εβδομάδες μετά την τελευταία επέμβαση μυκητοκτόνου. Οι ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο με Daconil SC (chlorothalonil 50%) 3 ml·L-1, Teldor WG (fenhexamid 50%) 1.5 g·L-1, Signum WG (boscalid 26.7% + pyraclostrobin 6.7%) 1.5 g·L-1, Switch WG (fludioxonil 25% + cyprodinil 37.5%) 0.5 g·L-1 και Ortiva Οpti SC (azoxystrobin 8% + chlorothalonil 40%) 2.5 ml·L-1, μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα και την ένταση της προσβολής σε σχέση με το μάρτυρα. Τα μυκητοκτόνα Switch WG και Signum WG έδωσαν την καλύτερη καταπολέμηση ενώ τα Teldor WG και Daconil SC ήταν λιγότερο αποτελεσματικά. Η εφαρμογή ενός ή δύο επιπλέον ψεκασμών μετά τη μεταφύτευση μείωσαν περαιτέρω το επίπεδο της ασθένειας. Η σταθερή ύπαρξη στο θερμοκήπιο ανθεκτικού πληθυσμού του παθογόνου φαίνεται ότι δεν περιόρισε την αποτελεσματικότητα των βοτρυδιοκτόνων. Δύο κυρίαρχοι φαινότυποι ανθεκτικοί σε πέντε (QoIRBosRAniRBenHRDicMR) και επτά (HydRQoIRBosRAniRPhenRBenHRDicMR) διαφορετικού τρόπου δράσης ομάδες μυκητοκτόνων εντοπίστηκαν είτε στο εναέριο μόλυσμα, είτε απομονώθηκαν από φυτά του πειραματικού ή του ευρύτερου χώρου του θερμοκηπίου. Για τη μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ανθεκτικότητας η εναλλαγή μυκητοκτόνων στο πρόγραμμα επεμβάσεων βρέθηκε απαραίτητη. Με εξαίρεση τις επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση με Daconil SC (chlorothalonil 50%), σε όλες τις άλλες περιπτώσεις είτε δεν ανιχνεύθηκαν υπολείμματα μυκητοκτόνων κατά τη συγκομιδή ή ανευρέθηκαν σε συγκεντρώσεις κατώτερες από αυτές που έχουν θεσπιστεί από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα.Σε θρεπτικά υποστρώματα εμπλουτισμένα με διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεως βοτρυδιοκτόνων από εννιά διαφορετικές ομάδες, προσδιορίστηκε η ελάχιστη παρεμποδιστική συγκέντρωση (MIC) της βλάστησης των σπορίων και του σχηματισμού αποικίας σε 100 απομονώσεις του B. cinerea. Με τη μέθοδο της σημειακής εναπόθεσης σπορίων οι συγκεντρώσεις αυτές επιλέχθηκαν για το διαχωρισμό των επιπέδων ευαισθησίας σε 818 απομονώσεις του παθογόνου από μαρούλια και άλλα κηπευτικά. Τρεις φαινότυποι με πολλαπλή ανθεκτικότητα στις υδροξυανιλίδες (Hyd), τις στρομπιλουρίνες (QoI), τα καρβοξαμιδικά (Bos), τις ανιλινοπυριμιδίνες (Ani), τις φαινυλοπυρρόλες (Phen), τα δικαρβοξιμιδικά (Dic) και τα βενζιμιδαζολικά (Βen), [HydRQoIRBosRAniRPhenMRBenHRDicMR, QoIRBosRAniRBenHRDicMR, QoIRBosRBenHRDicMR] ανευρέθηκαν σε συχνότητα 7%, 12% και 6%, αντίστοιχα. Οι φαινότυποι αυτοί εντοπίστηκαν κυρίως σε καλλιέργεια θερμοκηπίου μαρουλιού στην περιοχή της Θεσσαλίας. Απομονώσεις ανθεκτικές μόνο στα βενζιμιδαζολικά (BenHR) βρέθηκαν στο 11% του δείγματος και προέρχονταν κυρίως από υπαίθριες καλλιέργειες μαρουλιού στη Μακεδονία και Πελοπόννησο. Σε χαμηλότερη συχνότητα (<5%) διαπιστώθηκαν φαινότυποι που παρουσίαζαν από 1 έως 5 διαφορετικούς συνδυασμούς ανθεκτικότητας στις χημικές ομάδες. Στο σύνολο των απομονώσεων που εξετάστηκαν δεν ανευρέθηκαν ανθεκτικά στελέχη στα μυκητοκτόνα fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια). Από τα ευρήματα διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία φαινοτύπων του B. cinerea με πολλαπλή ανθεκτικότητα σε επτά διαφορετικές ομάδες μυκητοκτόνων και η παρουσία στελεχών με υψηλή ανθεκτικότητα στο fenhexamid (Hyd) και μέτρια στο fludioxonil (Phen), αντίστοιχα. Για τη μείωση των ζημιών από βοτρύτη η εφαρμογή στρατηγικής διαχείρισης της ανθεκτικότητας κρίνεται απαραίτητη.Διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα in situ επτά μυκητοκτόνων διαφορετικού βιοχημικού τρόπου δράσεως [pyraclostrobin (στρομπιλουρίνες), boscalid (καρβοξαμιδικά), fenhexamid (υδροξυανιλίδες), cyprodinil (ανιλινοπυριμιδίνες), fludioxonil (φαινυλοπυρρόλες), fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια)], κατά εννιά επιλεγμένων με πολλαπλή ανθεκτικότητα απομονώσεων του B. cinerea. Νεαρά φύλλα μαρουλιού (ποικ. Penelope RZ) εμβαπτίστηκαν σε υδατικό αιώρημα μυκητοκτόνων, στη συνιστώμενη για ψεκασμό συγκέντρωση σε δ.ο. Μετά το στέγνωμα τα φύλλα τοποθετήθηκαν σε τριβλία Petri με αποστειρωμένο υπόστρωμα άγαρ. Ακολούθησε μόλυνση στη πάνω επιφάνεια με εναπόθεση ανεστραμμένου μυκηλιακού δίσκου διαμέτρου 5 mm ή σταγόνας αιωρήματος σπορίων συγκέντρωσης 5x104 mL-1. Η αποτελεσματικότητα αξιολογήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου ανάπτυξης της κηλίδας προσβολής του παθογόνου, έπειτα από 3 (μόλυσμα μυκήλιο) ή 6 (μόλυσμα σπόρια) μέρες επώαση, αντίστοιχα, σε θάλαμο θερμοκρασίας 18°C και 10h φωτισμού. Τα pyraclostrobin (0.4 g·L-1) και fenhexamid (1.5 g·L-1) απέτυχαν να εμποδίσουν την ανάπτυξη κηλίδας προσβολής των ανθεκτικών σε αυτά φαινοτύπων σε όλες τις περιπτώσεις δοκιμών. Παρόμοια αποτελέσματα διαπιστώθηκαν για τα boscalid (0.8 g·L-1), cyprodinil (0.375 και 0.75 g·L-1) και fludioxonil (0.25 και 0.5 g·L-1) όταν χρησιμοποιήθηκε ως μόλυσμα μυκήλιο. Απεναντίας, τα μυκητοκτόνα fluazinam (0.4 g·L-1) και chlorothalonil (2.5 g·L-1) ήταν αποτελεσματικά σχεδόν εναντίον όλων (εκτός από μία περίπτωση) των φαινοτύπων του παθογόνου. Από τα αποτελέσματα διαφαίνεται η αδυναμία πρόσφατα εισαχθέντων μυκητοκτόνων να εμποδίσουν την προσβολή από ανθεκτικούς φαινοτύπους του B. cinerea που απομονώθηκαν από καλλιέργειες μαρουλιού.Με τη νέα μέθοδο της θερμικής αποδιάταξης υψηλής ανάλυσης (HRM) τριάντα έξι διαφορετικής ευαισθησίας απομονώσεις του B. cinerea διαχωρίστηκαν γονοτυπικά με βάση μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα μυκητοκτόνα fenhexamid, boscalid, pyraclostrobin, carbendazim και iprodione. Η βασική αρχή λειτουργίας της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός του ρυθμού αποδιάταξης του δίκλωνου DNA με τη βοήθεια φθορίζουσας χρωστικής και ο σχηματισμός των χαρακτηριστικών καμπυλών τήξης του κάθε γενοτύπου. Μετά από ταυτοποίηση των καμπυλών τήξης βρέθηκε ότι τα ανθεκτικά στο fenhexamid στελέχη παρουσίασαν μετάλλαξη της φαινυλαλανίνης είτε σε βαλίνη (58% των απομονώσεων) είτε σε σερίνη (42% των απομονώσεων) στη θέση 412 του γονιδίου erg27. Παρομοίως, τα ανθεκτικά στο boscalid στελέχη έφεραν τη μετάλλαξη της ιστιδίνης είτε σε αργινίνη (78%) είτε σε τυροσίνη (22%) στη θέση 272 του γονιδίου sdhB. Στα ανθεκτικά στο pyraclostrobin στελέχη η μετάλλαξη της γλυκίνης σε αλανίνη παρουσιαζόταν στη θέση 143 του κυτοχρώματος b αλλά όχι πάντοτε. Στην ίδια γενωματική περιοχή ανιχνεύθηκε η ύπαρξη ενός εσονίου 1205 βάσεων στο 43% των ευαίσθητων στα QoIs στελεχών. Η υψηλή και μέτρια ανθεκτικότητα στο carbendazim συνδυάστηκε με μεταλλάξεις σε δύο διαφορετικές, πολύ κοντινές θέσεις του γονιδίου BenA (E198A και 200Υ). Έντονος πολυμορφισμός διαπιστώθηκε στα μετρίως ανθεκτικά στο iprodione στελέχη καθώς στο γονίδιο bos1 ανιχνεύθηκαν τέσσερεις διαφορετικοί γενότυποι ήτοι: α) I365N (46%), β) I365S (17%), γ) Q369P & N373S (17%), δ) V368F & Q369H (20%). Επιπρόσθετη πληθυσμιακή κατάταξη των απομονώσεων με βάση την ύπαρξη μεταθετών στοιχείων boty και flipper έδειξε ότι το 80% των απομονώσεων έφερε και τα δύο μεταθετά στοιχεία, το 15% κανένα από τα δύο ενώ το 5% μόνο το boty μεταθετό στοιχείο. Η γoνοτύπηση έδειξε ότι στους περισσότερους φαινοτύπους πολλαπλής ανθεκτικότητας οι μεταλλάξεις ήταν τυχαίες, ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις υπήρξε υψηλή συσχέτιση ορισμένων μεταλλάξεων με συγκεκριμένους φαινοτύπους. Τα συγκριτικά πλεονεκτήματα της μεθόδου HRM έναντι των παραδοσιακών μοριακών τεχνικών την καθιστούν ιδανική για μελέτες ανίχνευσης ανθεκτικών στελεχών.