Έλεγχος ασθενών με συγγενείς ανωμαλίες με τη μέθοδο του μοριακού καρυοτύπου/ Array-CGH: συσχέτιση του γονότυπου με το φαινότυπο

Abstract

The definition of congenital anomalies refers to any structural, functional, metabolic disorder that occurs in the fetus during prenatal development and becomes evident either at birth or later in neonatal / infant or subsequent age, resulting in physical or mental disability. It is estimated that at least 2% of fetuses and infants have major congenital abnormalities, reaching about 6-7% in systematic registers of congenital abnormalities. They account for 1/3 of pediatric input, and about 20 to 25% of the causes of death during the perinatal period, occupying the first cause of death in infancy throughout the Western world. In 30% of infants with structural anomalies that will survive the perinatal period, their life in neonatal and early infancy is still threatened. They are the second leading cause of death among ages between 1 and 5 years following childhood accidents while they are among at the top five causes of death during adolescence. Congenital abnormalities with or without mental retardation/ autism spectrum disorders (ASD) may be due to chromosomal abnormalities identified in about 1/200 neonates by conventional karyotype. However, classical cytogenetic analysis is not able to reliably detect genomic rearrangements of less than 5 to 10 megabases (Mb), or the chromosomal origin of the marker chromosome, nor the exact breakage position of the rearrangements. Thus, with the established karyotype genetic testing for congenital abnormalities, chromosomal abnormalities are only revealed at 0.5%, while more than 25% of patients with deformities and mental retardation remain undiagnosed. The Molecular Kayrotype technology with array-CGH microarrays further improves diagnostic genetic tests and bridges the gap between cytogenetic (conventional karyotype) and molecular genetic analysis . With the application of the Molecular Karyotype, submicroscopic unbalanced chromosomal rearrangements of several kilobases (Kb) to several megabases (Mb) are detected throughout the chromosome, contributing to a reduction in the incidence of undiagnosed cases of multiple congenital abnormalities, mental retardation or/and peculiar faces. In the context of this PhD for the detection of Copy Number Variations (CNVs), high resolution microarrays were used in 197 patients with relapsing abnormalities, with or without mental retardation / ASD (92 males, 105 females), aged from 1 day to 35 years old. Array-CGH identified only Copy Number Polymorphisms (CNPs) in 75 patients, pathological CNVs not associated with congenital abnormalities in 41 patients and pathological CNVs associated with congenital abnormalities in 81 patients (41%).20 out of 81 patients had congenital abnormalities, 57 out of 81 patients had congenital abnormalities with mental retardation and 4 out of 81 patients had congenital abnormalities with mental retardation and ASD. The majority of the 133 CNVs found in 81 patients were microdeletions (89/133) with a frequency of 67%, while the microduplications were less frequent (44/133) at a frequency of 33%. In 47 patients with congenital abnormalities the pathological phenotype was associated with 1 CNV, in 21 cases with 2 CNVs, while in 13 patients with 3 or more CNVs. The size of detected CNVs varies from 8 Kb to 22.5 Mb. In a total of 62/81 patients have been identified with known microduplications and microdeletions syndromes that have been described in the literature in individuals with the same or similar clinical phenotype.

Ο όρος συγγενείς ανωμαλίες αναφέρεται σε κάθε δομική, λειτουργική, μεταβολική διαταραχή που συμβαίνει στο έμβρυο κατά την διάρκεια της προγεννητικής ανάπτυξης και γίνεται εμφανής είτε στη γέννηση είτε αργότερα στη νεογνική/ βρεφική ή μετέπειτα ηλικία, με αποτέλεσμα τη σωματική ή νοητική μειονεξία. Υπολογίζεται τουλάχιστον ότι το 2% των εμβρύων και των βρεφών παρουσιάζουν μείζονες συγγενείς ανωμαλίες, φτάνοντας περίπου το 6-7% σε μητρώα συστηματικής καταγραφής συγγενών ανωμαλιών. Αντιπροσωπεύουν το 1/3 των εισαγωγών σε παιδιατρικά τμήματα, και περίπου το 20 με 25% των αιτιών θανάτου κατά την περιγεννητική περίοδο, κατέχοντας την πρώτη αιτία θανάτου στη βρεφική ηλικία σε όλο το δυτικό κόσμο. Στο 30% των νεογνών με τις δομικές ανωμαλίες που θα επιβιώσουν στην περιγεννητική περίοδο συνεχίζεται να απειλείται η ζωή τους στην νεογνική και πρώτη βρεφική ηλικία. Στις ηλικίες μεταξύ 1 έως 5 ετών καταλαμβάνουν τη δεύτερη κατά σειρά αιτία θανάτου μετά τα παιδικά ατυχήματα, ενώ βρίσκονται μέσα στις πρώτες πέντε αιτίες θανάτου κατά την εφηβεία. Οι συγγενείς ανωμαλίες με ή χωρίς νοητική υστέρηση/ δυσμορφίες/ διαταραχές φάσματος αυτισμού μπορεί να οφείλονται σε αδρές χρωμοσωμικές ανωμαλίες που εντοπίζονται σε περίπου 1 ανά 200 νεογνά με τον απλό (συμβατικό) καρυότυπο. Ωστόσο η κλασική κυττταρογενετική ανάλυση δεν είναι σε θέση να εντοπίσει αξιόπιστα ανακατατάξεις (ελλείμματα ή διπλασιασμούς) γενομικών τμημάτων μικρότερων των 5 εώς 10 μεγαβάσεων (Mb), ή τη χρωμοσωμική προέλευση των υπεράριθμων χρωμοσωμικών δεικτών (markers) ούτε τη θέση θραύσης των αναδιατάξεων. Έτσι στις μείζονες συγγενείς ανωμαλίες με τον καθιερωμένο γενετικό έλεγχο με καρυότυπο, συνολικά παραμένουν αδιάγνωστοι πάνω από 25% των ασθενών που έχουν υπομικροσκοπικές χρωμοσωμικές ανακατατάξεις. Προκειμένου να βελτιωθούν περαιτέρω οι διαγνωστικές γενετικές δοκιμασίες και να γεφυρωθεί το χάσμα μεταξύ της κυτταρογενετικής (κλασικός καρυότυπος) και της μοριακής γενετικής ανάλυσης μεταλλάξεων (DNA ανάλυση) έχει αναπτυχθεί η τεχνολογία του Μοριακού Καρυοτύπου με Μικροσυστοιχίες Συγκριτικού Γενωμικού Υβριδισμού (array-CGH). Με την εφαρμογή του Μοριακού Καρυοτύπου, ανιχνεύονται σε όλο το μήκος των χρωμοσωμάτων υπομικροσκοπικές μη ισοζυγισμένες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις μεγέθους μερικών κιλοβάσεων (Kb) έως πολλών μεγαβάσεων (Mb), συμβάλλοντας καταλυτικά στη μείωση του ποσοστού περιπτώσεων πολλαπλών συγγενών ανωμαλιών και ΝΥ ή δυσμορφιών αγνώστου αιτιολογίας οι οποίες παρέμεναν αδιάγνωστες. Στα πλαίσια της εκπόνησης της παρούσης διδακτορικής διατριβής για τον εντοπισμό Copy Number Variations (CNVs) χρησιμοποιήθηκαν οι υψηλής διακριτικής ικανότητας μικροσυστοιχίες σε 197 ασθενείς με συγγενείς ανωμαλίες, με /ή χωρίς ΝΥ/ΔΑΦ (92 άρρενα, 105 θήλεα), ηλικίας από 1 ημερών έως 35 ετών. Η μελέτη array-CGH έδειξε φυσιολογικά αποτελέσματα σε 75 ασθενείς, CNVs που δεν σχετίζονται με συγγενείς ανωμαλίες σε 41 ασθενείς και παθολογικά CNVs που σχετίζονται με συγγενείς ανωμαλίες σε 81 ασθενείς (41%), χωρίς να ληφθούν υπόψη οι πολυμορφικές αλληλουχίες Copy Number Polymorphisms (CNPs). Από τους 81 ασθενείς με παθολογικά CNVs οι 20 είχαν συγγενείς ανωμαλίες χωρίς άλλα ευρήματα, οι 57 είχαν συγγενείς ανωμαλίες με ΝΥ και συγγενείς ανωμαλίες με ΝΥ και ΔΑΦ είχαν οι 4 στους 81. Η πλειοψηφία των 133 CNVs που εντοπίστηκαν συνολικά στους 81 ασθενείς ήταν μικροελλείμματα (89/133) με συχνότητα 67%, ενώ οι μικροδιπλασιασμοί ήταν σπανιότεροι (44/133) με συχνότητα 33%. Σε 47 ασθενείς ο παθολογικός φαινότυπος συνδέεται με 1 CNV, σε 21 ασθενείς με 2 CNVs, ενώ σε 13 ασθενείς συνδέθηκε με 3 ή περισσότερα CNVs. To μέγεθος των CNVs που εντοπίστηκαν ποικίλλει από 8 Kb έως 22,5 Mb. Γνωστά σύνδρομα μικροελλειμμάτων και μικροδιπλασιασμών που έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία σε άτομα με ίδιο ή παρόμοιο κλινικό φαινότυπο εντοπίστηκαν σε συνολικά 62/197 ασθενείς που περιελήφθησαν συνολικά στη μελέτη.