Μοριακός καρυότυπος στην προγεννητική διάγνωση

Abstract

Karyotyping has been the golden standard method for prenatal diagnosis fordecades, for the diagnosis of numerical and large structural abnormalities (<3-10Mb).With the introduction of array Comparative Genomic Hybridization (CGH) analysis inpostnatal analysis and its use as a first-tier test in cases of Intellectual disabilities, ithas been postulated that this method might also become the first-tier test in prenataldiagnosis as well. Αrray CGH is a technology that has demonstrated that it is a highthroughput, comprehensive and fast and has proven its ability to detect copy numberchanges that can go undetected by light microscopy.The aim of this study was the application of high-resolution microarrays in prenataldiagnosis for the detection of cryptic microduplications and microdeletions in fetuseswith ultrasound abnormalities and normal karyotype, and also to further investigatethe abnormalities in fetuses with balanced or unbalanced rearrangements with orwithout ultrasound findings. This research aimed to provide new scientific knowledgeand benefits in fetal medicine and genetics, and to prove that the application ofhigher diagnostic resolution in prenatal diagnosis is possible.Array CGH was carried out to detect submicroscopic chromosomal imbalances,using commercially available Bacterial Artificial Chromosome (BAC) andoligonucleotide microarrays (Cytochip BlueGnome), as well as the Sanger Tiling PathBAC arrays. All Copy Number Changes (CNCs) revealed in array analysis wereconfirmed by a second method. A total of 202, out of which 129 were prenatal, and64 parental samples were analyzed. Prenatal samples were tested either because: 1)they had normal karyotype and ultrasound abnormalities, 2) apparently balancedrearrangement and ultrasound abnormalities, 3) an apparently balanced structural aberration without abnormal ultrasound findings, 4) an abnormal karyotype withabnormal ultrasound findings, 5) an abnormal karyotype/ MLPA/QF-PCR withoutabnormal ultrasound findings which required further investigation, 6) even though thekaryotype was eventually normal and there were no ultrasound findings array CGHwas carried out because of maternal anxiety due to an abnormal previous pregnancyor to rule out a possible abnormality which was revealed during chromosomal/ MLPA/Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) analyses.Fifty prenatal samples were analyzed with 1Mb BAC arrays, 34 with 105K and 11with 180K oligonucleotide arrays and 34 samples were analyzed with Tiling path BACarray. Seventeen abnormal cases (17/95, 17.9%) were determined by array CGHanalysis. Seven of the abnormal cases were from pregnancies which had ultrasoundabnormalities and a normal karyotype, whereas 9 of the abnormalities wereinvestigations of abnormalities detected by other methods (G Banding, MLPA, QFPCR) (9/17, 53%). By excluding the nine abnormalities previously detected with othermethods the detection rate of this method is 8.1% (7 out of 86 samples).The current prenatal cohort included 34 cases that had a normal karyotype and wereterminated due to major ultrasound abnormalities. Array CGH analysis of theses 34fetuses revealed 627 Copy Number Changes (CNC). After comparison to knownaberrations listed in publically available databases, (DECIPHER (DatabasE ofChromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources,Database of Genomic Variants DGV) it was determined that these CNCs were foundwithin normal copy number variant regions and were excluded from any furtherinvestigation. These CNCs were considered of no clinical significance as they couldalso be found in normal controls and thus were most probably not associated with theclinical findings. Finally among the 202 samples there were 73 cases of Products of Conception/intrauterine death /Stillbirth (POC/SB) samples which were initially received forchromosomal analysis. Due to failure of these samples to grow in vitro , additionaltissue kept in storage was used for DNA extraction, so that they could be used in(QF- PCR) and array CGH analyses.Out of the 73 POC/SB samples, 16 cases were completed by QF PCR analysis only,as the causative abnormality was detected and there was no need to proceed withany further investigation and 57 cases were further investigated using array CGHanalysis. Out of the 16 abnormalities detected with QF PCR analysis 13 were firsttrimester and 3 were second trimester miscarriages; 4 triploidies, 8 autosomaltrisomies and 4 sex chromosome abnormalities. Out of the 57 cases investigatedwith array CGH, 49 were analyzed using BAC arrays and 8 were analyzed usingOligo arrays. A total of 9 aneuploidies were detected by BAC arrays analysis, ofwhich 7 were autosomal and 2 were sex chromosome aneuploidies. Eight of thoseaneuploidies were first trimester and one was second trimester miscarriage. Inaddition 1 benign familial CNC was detected by oligo array analysis.Array CGH analysis has been proven to be a valuable tool for the determination ofcopy number changes in children with congenital abnormalities and it has replacedkaryotyping in some laboratories. It has proven its value in Products of Conception/Intrauterine death /Stillbirth as shown in this study by having the advantage tocircumvent technical problems associated with tissue culturing thus leading to thefailure of providing results by classical cytogenetics.In prenatal diagnosis chromosomal analysis is still the primary choice of testing; ithas to overcome some of its limitations, such as the detection of CNCs of unclearsignificance or coincidental findings, before it can fully replace chromosomal analysisin prenatal diagnosis. Αs it was shown, by our results and those of others, the detection rate in clinically significant copy number changes is increased by 8% withthe application of array CGH in cases were the karyotype is normal and there aresonographic malformations in the fetus it can be used more extensively in prenataldiagnosis as well. Furthermore in 9 cases it has provided additional information,valuable for the clinical interpretation of the findings detected by othermethodologies.

Η χρωμοσωμική εξέταση είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται στην προγεννητικήδιάγνωση για δεκαετίες, για τη διάγνωση αριθμητικών και μεγάλων δομικώνανωμαλιών (< 3-10 Mb). Με την εισαγωγή της μεθοδολογίας του συγκριτικούγενωμικός υβριδισμού με μικροστυστοιχίες (array CGH) στην μεταγεννητικήανάλυση και τη χρήση τους ως την πρώτη επιλογή εξέτασης σε περιπτώσεις ατόμωνμε διανοητική αναπηρία, έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η μέθοδος αυτή μπορεί κάποιαμέρα να αποτελέσει τη πρώτη μέθοδο επιλογής και στην προγεννητική διάγνωση. Ηarray CGH έχει αποδειχθεί να είναι μια τεχνολογία υψηλής απόδοσης, περιεκτική καιγρήγορη. Έχει επίσης την ικανότητα να ανιχνεύει αλλαγές σε γενετικό υλικό που ναείναι μη ανιχνεύσιμες στο μικροσκόπιο.Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η εφαρμογή υψηλής ευκρίνειας μικροσυστοιχιώνστην προγεννητική διάγνωση για τον εντοπισμό κρυπτικών μικροδιπλασιασμών καιμικροελλειμάτων σε έμβρυα με φυσιολογικό καρυότυπο αλλά με σοβαράυπερηχογραφικά ευρήματα (συγγενείς ανωμαλίες, δυσμορφίες) και επίσης ναδιερευνήσει περαιτέρω σε έμβρυα με ήδη ανιχνευμένες, με άλλες μεθόδους,ανωμαλίες με ισορροπημένες ή μη ισορροπημένες ανακατατάξεις με ή χωρίςυπερηχογραφικά ευρήματα. Αυτή η έρευνα είχε ως στόχο να προσφέρει νέεςεπιστημονικές γνώσεις και οφέλη στην εμβρυϊκή ιατρική και στη γενετική, και νααποδείξει ότι είναι δυνατή η εφαρμογή της array CGH στην προγεννητική διάγνωση.Array CGH πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση μικροσκοπικών χρωμοσωμικώνατυπιών, χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμες μικροσυστοιχίες με BAC κλώνουςκαι μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων (Cytochip, BlueGnome, UK), καθώς και μεμικροσυστοιχίες με BAC κλώνους με μερική αλληλοεπικάλυψη του ΙνστιτούτουSanger. Οποιεσδήποτε αλλαγές ανιχνεύθηκαν στον αριθμό αντιγράφων του DNAεπιβεβαιώθηκαν και από δεύτερη μέθοδο. Αναλύθηκαν συνολικά 202 περιστατικά, εκ των οποίων τα 129 ήταν προγεννητικές, και 64 δείγματα από γονείς. Οιπρογεννητικές παραπομπές έγιναν είτε διότι: 1) είχαν φυσιολογικό καρυότυπο ενώταυτόχρονα είχαν υπερηχογραφικά ευρήματα, 2) ισορροπημένη ανακατάταξη στονκαρυότυπο και υπερηχογραφικά ευρήματα, 3) ισορροπημένη ανακατάταξη στονκαρυότυπο χωρίς όμως υπερηχογραφικά ευρήματα, 4) ανωμαλία στον καρυότυποκαι υπερηχογραφικά ευρήματα, 5) ανίχνευση ανωμαλίας στον καρυότυπο /MLPA/QF-PCR χωρίς όμως υπερηχογραφικά ευρήματα τα οποία χρειάζοντανπεραιτέρω διερεύνηση, 6) κάποια περιστατικά που παρόλο ότι είχαν φυσιολογικόκαρυότυπο και καθόλου υπερηχογραφικά ευρήματα, διενεργήθηκε array CGH είτελόγω ανησυχίας των γονιών λόγω ύπαρξης ανωμαλίας σε προηγούμενη κύηση ή γιανα αποκλείσει μια πιθανή ανωμαλία που αποκαλύφθηκε κατά τη ανάλυση μεκαρυότυπο / MLPA / QF-PCR.Πενήντα προγεννητικές αναλύθηκαν με BAC arrays ευκρίνειας μίας Μεγαβάσης, 34με μικροστυστοιχίες 105,000 ολιγονουκλεοτιδίων και 11 με μικροστυστοιχίες 180,000ολιγονουκλεοτιδίων, και 34 δείγματα αναλύθηκαν με Tiling Path BAC array.Ανιχνεύθηκαν 17 ανώμαλα περιστατικά με την array CGH ποσοστό που ανέρχεταιστο 17.9% (17/95). Επτά από τα ανώμαλα περιστατικά προέρχονταν απόεγκυμοσύνες με φυσιολογικό καρυότυπο και ευρήματα στους υπέρηχους, ενώ 9(9/17, 53%) από τις ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν αποτελούσαν διερεύνησηπεριστατικών με ανωμαλίες που διαγνώστηκαν με άλλες μεθόδους (χρωμοσωμικήεξέταση, MLPA, QF- PCR). Αποκλείοντας τα εννέα αυτά περιστατικά από τουςυπολογισμούς μας το ποσοστό ανίχνευσης της μεθόδου αυτής είναι 8.1% (7/86).Το σύνολο των περιστατικών της μελέτης αυτής περιλάμβανε και 34 περιστατικά μεφυσιολογικό καρυότυπο στα οποία έγινε τερματισμός εγκυμοσύνης λόγω σοβαρώνυπερηχογραφικών ευρημάτων. Η ανάλυση κατά array CGH των 34 αυτών εμβρύωνφανέρωσε 627 αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων του DNA (CNC). Κατόπινσυγκρίσεως των αλλαγών αυτών στη γενετική σύσταση αυτών των εμβρύων με γνωστές ανωμαλίες που απαριθμούνται σε δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων,DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans usingEnsembl Resources), DGV (Database of Genomic Variants) καθορίστηκε ότι οιπλείστες περιέχονται στη λίστα πολυμορφισμών και εξαιρέθηκαν από περαιτέρωδιερεύνηση. Αυτές οι αλλαγές δεν θεωρήθηκαν κλινικής σημασίας εφόσον βρέθηκανκαι σε φυσιολογικούς μάρτυρες, κι επομένως το πιο πιθανόν να μην σχετίζονται μετις υπερηχογραφικές ανωμαλίες των εμβρύων αυτών.Τέλος ανάμεσα στα 202 δείγματα υπήρχαν και 73 περιστατικά από αυτόματεςαποβολές/ ενδομήτριος θάνατος /Θνησιγένεια (POC/SB) τα οποία είχαν αρχικάπαραπεμφθεί για χρωμοσωμική εξέταση. Λόγω όμως του γεγονότος ότι ταπεριστατικά αυτά δεν αναπτυχθήκαν στις καλλιέργειες επιπρόσθετο υλικό πουπαρακρατήθηκε από αυτά χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση DNA, ούτως ώστε ναχρησιμοποιηθεί για ανάλυση με άλλες μεθόδους (QF- PCR και array CGH).Από τα 73 POC/SB αυτά δείγματα, 16 περιστατικά ολοκληρώθηκαν μόνο με τημέθοδο της Ποσοτικής Φθορίζουσας Αλυσιδωτής αντίδρασης της Πολυμεράσης (QFPCR),καθώς με αυτή ανιχνεύθηκε επιτυχώς ο λόγος της αποβολής και δεν υπήρχελόγος να προχωρήσουμε σε περαιτέρω διερεύνηση. Στα υπόλοιπα 57 περιστατικάεφαρμόστηκε η array CGH.Από τις 16 ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν με την μέθοδο QF-PCR, οι 13 ήταναποβολές πρώτου τριμήνου και οι τρεις ήταν αποβολές δευτέρου τριμήνου. Σ’ αυτέςσυμπεριλαμβάνονταν 4 τριπλοειδίες, 8 αυτοσωμικές τρισωμίες και 4 ανωμαλίες τωνφυλετικών χρωμοσωμάτων. Από τα 57 περιστατικά των οποίων η ανάλυσηδιεκπεραιώθηκε με array CGH, τα 49 αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες BAC και τα 8αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Συνολικά ανιχνεύτηκαν 9ανευπλοειδίες με μικροσυστοιχίες BAC, από τις οποίες οι 7 ήταν αυτοσωμικές και οι2 ήταν ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Οκτώ από τις ανευπλοειδίες αυτές ήταν πρώτου τριμήνου και μία ήταν δευτέρου. Επιπρόσθετα με εφαρμογήμικροσυστοιχίας ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνεύθηκε και μια καλοήθης CNCκληρονομημένη από τον ένα γονιό.Η εφαρμογή της μεθόδου array CGH έχει αποδειχθεί ένα πολύτιμο εργαλείο για τονπροσδιορισμό των αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων σε παιδιά με συγγενείςανωμαλίες και έχει αντικαταστήσει τη χρωμοσωμική ανάλυση σε αρκετά εργαστήρια.Έχει αποδειχθεί επίσης η αξία της στη χρήση της και σε αποβολές/ Ενδομήτριουθανάτου /Θνησιμότητας, όπως φαίνεται στην παρούσα μελέτη έχοντας τοπλεονέκτημα να παρακάμψει τις τεχνικές δυσκολίες που συναντούμε συχνά καισχετίζονται με την αδυναμία ανάπτυξης ινοβλάστων σε καλλιέργεια, και ακολούθωςστη αποτυχία διάγνωσης του περιστατικού με την κλασσική κυτταρογενετική.Στη προγεννητική διάγνωση η χρωμοσωμική ανάλυση εξακολουθεί να αποτελεί τηνπρώτη επιλογή εξέτασης. Η μέθοδος αυτή πρέπει να ξεπεράσει κάποιους από τουςπεριορισμούς της πριν να μπορέσει να αντικαταστήσει ίσως τη χρωμοσωμικήεξέταση. Έχει αποδειχθεί όμως τόσο από εμάς όσο και από αποτελέσματα άλλων,ότι η συχνότητα ανίχνευσης των αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων με κλινικήσημασία αυξάνεται κατά 8%, με την εφαρμογή της array CGH σε περιπτώσεις μεφυσιολογικό καρυότυπο και υπερηχογραφικά ευρήματα στο έμβρυο, οπότε ημέθοδος αυτή ίσως να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρύτερα και στην προγεννητικήδιάγνωση. Επιπρόσθετα σε 9 περιπτώσεις η μέθοδος αυτή παρείχε πληροφορίεςπολύτιμες για την ερμηνεία των ευρημάτων που εντοπίστηκαν από άλλες μεθόδους.