Μελέτη του DNA και της τουμπουλίνης στα ανθρώπινα αγονιμοποίητα ωοκύτταρα και προεμφυτευτικά έμβρυα με συνεστιακό laser σαρωτικό μικροσκόπιο

Abstract

Aim: The aim of this study is the investigation of the spatial distribution and abnormalities of chromatin and tubulin in the human unfertilized oocytes and preimplantation embryos. Materials & Methods: This study included 243 human unfertilized oocytes after the implementation of one of the in vitro fertilization methods and 139 embryos which were arrested before embryo transfer. Chromatin configuration and spatial distribution were studied. In addition tubulin distribution was studied in 65 of the oocytes and in 37 of the embryos Chromomycin A3 and propidium iodide were used for the fluorescence of the DNA and anti β tubulin - FITC antibodies were used for tubulin fluorescence. The observation was performed by confocal laser scanning microscope. Results: Most unfertilized oocytes displayed chromatin in metaphase II and normal appearing meiotic spindle while the rest of them displayed dispersed chromosomes and/or disarrayed meiotic spindle. The distance between paternal and maternal chromatin depended on the method of the in vitro fertilization. In the more advanced stages which the embryos were arrested they displayed more abnormalities including cellular fragments a nuclear or multinuclear blastomeres. In most embryos clusters of tubulin were formed while arrays of microtubules were presented in fewer embryos. Conclusions: The fertilization failure of most oocytes was not attributed to abnormalities of the configuration of chromatin or meiotic spindle. The distance between paternal and maternal chromatin was related to the mobility of the spermatozoa. The ability of the embryo for development might be related to the quality of the oocyte.

Σκοπός: Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της τρισδιάστατης κατανομής και των ανωμαλιών της χρωματίνης και της τουμπουλίνης στα ανθρωπινά αγονιμοποίητα ωοκύτταρα και προεμφυτευτικά έμβρυα. Υλικό & Μέθοδος: Η μελέτη περιέλαβε 243 αγονιμοποίητα ωοκύτταρα που προέκυψαν μετά από εφαρμογή τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης και 139 έμβρυα που διέκοψαν την ανάπτυξη τους πριν από την εμβρυομεταφορά. Μελετήθηκε η διαμόρφωση της χρωματίνης και η τρισδιάστατη κατανομή της. Επιπλέον σε 65 από τα ωοκύτταρα και 37 από τα έμβρυα μελετήθηκε ταυτόχρονα η κατανομή της τουμπουλίνης. Για το φθορισμό του DNA χρησιμοποιήθηκε chromomycin A3 και propidium iodide και για το φθορισμό της τουμπουλίνης αντίσωμα anti β tubulin - FITC και παρατηρήθηκαν με συνεστιακό laser σαρωτικό μικροσκόπιο. Αποτελέσματα: Τα περισσότερα αγονιμοποίητα ωοκύτταρα είχαν χρωμοσώματα στη μετάφαση II και είχαν καλά σχηματισμένη μειωτική άτρακτο ενώ τα υπόλοιπα ωοκύτταρα είχαν διασκορπισμένα χρωμοσώματα στη μετάφαση II η/και διαλυμένη μειωτική άτρακτο. Η απόσταση των σπερματοζωαρίων από τα μητρικά χρωμοσώματα εξαρτάται από τη μέθοδο εξωσωματικής γονιμοποίησης. Όσο προχωρούσε το στάδιο ανάπτυξης των εμβρύων τόσο περισσότερες ανωμαλίες παρουσίαζαν όπως κυτταροπλασματικά θραύσματα απύρηνα η πολυπύρηνα βλαστομερίδια. Στα περισσότερα έμβρυα η τουμπουλίνη συγκεντρώνεται σε εστίες μέσα στο κυτταρόπλασμα τους ενώ σπανιότερα σχηματίζεται δίκτυο από μικροσωληνίσκους. Συμπεράσματα: Η αποτυχία της γονιμοποίησης στα περισσότερα ωοκύτταρα δεν οφείλεται σε ανωμαλίες της διαμόρφωσης του DNA ή της μειωτικής ατράκτου. Η απόσταση του σπερματοζωαρίου από τα μητρικά χρωμοσώματα πρέπει να σχετίζεται με την κινητικότητα τους. Η ποιότητα του ωοκυττάρου φαίνεται να συνδέεται με την ικανότητα ανάπτυξης του εμβρύου.