Διερεύνηση της σχέσης δομής-λειτουργίας ανθρώπινων απολιποπρωτεϊνών με τη χρήση βιοφυσικών τεχνικών: αποΕ και δυσλιπιδαιμίες

Abstract

Naturally occurring mutations in apoE gene have been linked with the development ofdyslipidemias. Furthermore, it has been shown that some artificially mutated forms of apoE canact theurapeutically against dyslipidemias in experimental animal models.ApoE is characterized by relatively low thermodynamic stability and significant structuralplasticity, both properties being necessary for its function. The unusual structural andthermodynamic properties of apoE have limited our understanding of the structure-functionrelationship in this molecule and consequently, its exact role in the pathogenesis of humandisease. During the course of this work, we hypothesized that the association of rare inheritedmutations in the molecule of apoE with the occurrence of dyslipidemias, or therapeutic actionagainst them, is linked to changes in the structural and thermodynamic properties of themolecule. To address this, we analyzed naturally-occurring apoE variants that are associatedwith the development of type III hyperlipoproteinemia (HLP III) or lipoprotein glomerulopathy(LPG), as well as artificial mutations linked with therapeutic properties towardshypertriglyceridemia in mouse models. We used recombinant DNA technology approaches togenerate the desired mutations and subsequently produced the recombinant forms of apoE inappropriate cellular expression systems. The recombinant protein variants were purified tohomogeneity and their biophysical properties were analyzed using circular dichroism, thermaland chemical denaturation, a hydrophobic fluorigenic probe, dynamic light scattering andcontrolled proteolysis. We also studied the apoE variants’ ability to form lipoprotein particles, aswell as the particles’ thermodynamic stability and their tendency to accumulate.Our results, taken as a whole, suggest that the insertion of even point mutations in the moleculeof apoE can cause dramatic changes to the thermodynamic stability and structural plasticity ofthe molecule depending on the location and the nature of the mutation. All of the studiedmutations in the molecule of apoE affect, to at least some degree, apoE’s structural andthermodynamic properties, and in some cases these changes point to potential mechanisms ofpathogenesis for the disease. Finally, our data highlight the importance of the aggregationproperties of apoE in the pathogenesis of LPG, as well as the role of the natural allelicbackground on the repercussions of the mutations to the thermodynamic and structuralproperties of apoE.

Η απολιποπρωτεΐνη Ε (αποΕ) είναι βασικό συστατικό του συστήματος μεταφοράς λιπιδίων μέσω λιποπρωτεϊνών. Φυσικά απαντώμενες μεταλλάξεις στο γονίδιο της αποΕ έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση δυσλιπιδαιμιών. Επιπροσθέτως, έχει δειχθεί πως κάποιες τεχνητά μεταλλαγμένες μορφές της αποΕ δρουν θεραπευτικά έναντι δυσλιπιδαιμιών σε πειραματικά μοντέλα ζώων.Η αποΕ χαρακτηρίζεται από σχετικά χαμηλή θερμοδυναμική σταθερότητα και σημαντική δομική πλαστικότητα, χαρακτηριστικά απαραίτητα για τη λειτουργία της. Η ιδιαιτερότητα των δομικών και θερμοδυναμικών ιδιοτήτων της αποΕ καθιστά δύσκολη την κατανόηση της πολύπλοκης σχέσης δομής- λειτουργίας της και κατά συνέπεια του ρόλου της στις ανθρώπινες ασθένειες.Στην παρούσα διατριβή υποθέσαμε πως η συσχέτιση σπάνιων κληρονομούμενων μεταλλάξεων στο μόριο της αποΕ με την εμφάνιση δυσλιπιδαιμιών ή θεραπευτικής δράσης έναντι αυτώνβασίζεται σε αλλαγές στις δομικές και θερμοδυναμικές ιδιότητες του μορίου.Για να προσεγγίσουμε τη μοναδική σχέση δομής- λειτουργίας της αποΕ πραγματοποιήσαμε βιοφυσική μελέτη στο μόριο της αποΕ στην οποία εισάγαμε φυσικά απαντώμενες μεταλλάξεις που σχετίζονται με τη νόσο υπερλιποπρωτεϊναιμία τύπου ΙΙΙ (ΥΛΠ ΙΙΙ) ή λιποπρωτεϊνική σπειραματοπάθεια (ΛΠΣ), καθώς και τεχνητές μεταλλάξεις που σχετίζονται με θεραπευτική δράση έναντι της υπερτριγλυκεριδαιμίας. Η πειραματική προσέγγιση που πραγματοποιήσαμε περιλαμβάνει την εισαγωγή μεταλλάξεων στο μόριο της αποΕ με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA, την παραγωγή ανασυνδυασμένων μορφών της αποΕ από κατάλληλα κυτταρικά συστήματα, τον καθαρισμό τους και ακολούθως, τη λήψη φασμάτων κυκλικού διχρωισμού, τη θερμική και χημική αποδιάταξη των μορίων, τη μελέτη της υδροφοβικότητας της αποΕ με χρήση φθορίζοντος ιχνηθέτη, τον υπολογισμό της υδροδυναμικής διαμέτρου με δυναμική σκέδαση φωτός, τη μελέτη της ευαισθησίας σε πρωτεόλυση, καθώς και το σχηματισμό και χαρακτηρισμό λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων που περιέχουν μεταλλαγμένα ή μη μόρια αποΕ. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν πως η εισαγωγή μεταλλάξεων- ακόμη και σημειακών-στο μόριο της αποΕ μπορεί να επάγει δραματικές αλλαγές στη θερμοδυναμική σταθερότητα και δομική πλαστικότητα του μορίου ανάλογα με τη θέση και φύση των μεταλλάξεων. Επίσης η ανάλυση υπέδειξε ότι όλες οι μελετηθείσες μεταλλάξεις στο μόριο της αποΕ επηρεάζουν τα δομικά και θερμοδυναμικά χαρακτηριστικά του μορίου, υποδεικνύοντας σε μερικές περιπτώσεις πιθανούςμηχανισμούς παθογένεσης και επιβεβαιώνοντας τη διαγνωστική αξία αυτών των μεταλλάξεων.Τέλος, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τη σημασία της συσσωμάτωσης της αποΕ στην παθογένεση ανθρώπινων ασθενειών καθώς και την επίδραση του πολυμορφικού υποβάθρου των μεταλλάξεων στις θερμοδυναμικές και δομικές ιδιότητες της αποΕ.