Μελέτη του ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε και της χοληστερόλης στην παθογένεση της νόσου Alzeimer's σε διαγονιδιακά ποντίκια

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease that is affecting the higher cognitive functions. It is the most common form of senile dementia and is mainly affecting people after the age of 65. Inheritance of the ε4 allele of Apolipoprotein E (ApoE4) is the major risk factor for the development of the sporadic form of AD. The LDLR is one of the main APOE receptors both in the circulation and in the CNS. In the present study the role of the LDLR was studied in a transgenic mouse model with Alzheimer’s-like pathology (5xFAD). In addition, the role of the peripheral-derived (non-CNS) APOE4 was analysed. To study the role of the LDLR in the pathogenesis of Alzheimer’s disease we have generated transgenic mice that develop an Alzheimer’s like phenotype (5xFAD transgenic mice) and lack the endogenous Ldlr gene (Ldlr-/-). The 5XFAD;Ldlr-/- mice were analysed for amyloid deposition and APOE levels and it was shown that amyloid plaques as well as amyloid β (Αβ) brain levels were increased irrespectively of the presence or the absence of APOE. The guanidine levels of APOE (plaque-associated fraction) were also increased in brain homogenates of 5XFAD;Ldlr-/- mice. There was no difference in levels of the total amyloid precursor protein (APP) or its carboxy-terminal fragments (CTF) indicating that the increase in the Aβ levels is probably due to defective clearance of amyloid. Furthermore, analysis of the inflammatory response showed a significant decrease in astrocytosis and microgliosis in the absence of LDLR independently of APOE. To study the role of peripheral-derived APOE in the pathogenesis of Alzheimer’s disease we generated transgenic mice that express the genomic human allele ε4 of ApoE under the transthyretin (TTRI) promoter (TTRI-huApoE4 transgenic mouse model). These mice express the transgene only in the liver and macrophages and not in the brain. The TTRI-huApoE4 transgenic mice were crossed with a mouse model with Alzheimer-like pathology (5xFAD). Pathogenesis of the AD-like phenotype was analysed in mice of the genotypes 5xFAD, 5xFAD;ApoE-/- and 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- with immunoblotting, ELISA and immunohistochemistry methods. Histological analysis showed that 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- had more hippocampal and cortical amyloid plaques than the 5xFAD;ApoE-/- mice. The 5xFAD mice that have the endogenous ApoE, had the most abundant load of Aβ and amyloid plaques compared to the other genotypes. Immunohistochemistry for the Aβ peptide revealed that the 5xFAD mice had the most intense and dense pattern of amyloid and the 5xFAD;ApoE-/- the most diffused. The 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- mice that express APOE4 only in the periphery and they don’t have the endogenous ApoE had a diffused pattern like the 5xFAD;ApoE-/- mice but the spatial distribution resembled the pattern of the 5xFAD’s Aβ deposition. Astrocytosis and microgliosis were also analysed in the aforementioned groups of mice. It was shown that microgliosis in the 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- was decreased compared to both the 5xFAD and the 5xFAD;ApoE-/- mice. In addition the microglia/macrophages (IBA1-positive cells) surrounding the amyloid plaques were also positive for huAPOE4 in the 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- mice. In order to establish if these cells were blood-derived infiltrating microglia/macrophages, 5xFAD;ApoE-/- mice received bone-marrow transplantation from Tg(CAG-EGFP)10sb/J;TTRI-huApoE4;ApoE mice which express the green fluorescent protein (GFP) in all cell types. We found that GFP-positive cells from the periphery infiltrated the blood-brain barrier and expressed APOE4. Also, the anti-inflammatory cytokine IL-10 was increased in the brains of 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- compared to the 5xFAD;ApoE-/-. Our data demonstrate the importance of LDLR in the amyloid plaque formation and the inflammatory response in the brain with Alzheimer-like pathology. Moreover, this study showed that peripheral expression of huApoE4 in the 5xFAD;TTRI-huApoE4 mice results in increased amyloid deposition and reduced microglial activation compared to the 5xFAD;ApoE-/- mice. Our proposed mechanism is that peripheral APOE promotes Aβ aggregation by modulating the activation of microglial cells through infiltration of huAPOE4-expressing macrophages in the brain, thus providing an accessible target to regulate in AD pathogenesis.

Η νόσος του Alzheimer (AD) είναι μια νευροεκφυλιστική νόσος που έχει ως αποτέλεσμα την προοδευτική απώλεια των ανώτερων γνωστικών λειτουργιών. Το αλληλόμορφο ε4 της Απολιποπρωτεΐνης Ε (Apolipoprotein E4, ApoE4) είναι ο κυριότερος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση της σποραδικής μορφής της νόσου. Ο LDLR, το αρχέγονο μέλος αυτής της υπεροικογένειας, είναι ο κυριότερος υποδοχέας της ΑΡΟΕ στον εγκέφαλο. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε ο ρόλος του LDLR και της προερχόμενης από την περιφέρεια ΑΡΟΕ4 στην παθογένεση της νόσου σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού με παθολογία τύπου Alzheimer. Για τη μελέτη του ρόλου του LDLR στη νόσο του Alzheimer αναλύθηκαν διαγονιδιακά ποντίκια με τη συγκεκριμένη παθολογία (ποντίκια 5xFAD) στα οποία είχε αποσιωποιηθεί το γονίδιο του Ldlr (5xFAD;Ldlr-/-). Στα ποντίκια 5xFAD;Ldlr-/- επισημάνθηκε αύξηση της ΑΡΟΕ στο συσχετιζόμενο με τις πλάκες κλάσμα από εκχύλισμα εγκεφάλων σε σχέση με τα ποντίκια 5xFAD που έχουν τον ενδογενή LDLR. Για να διασαφηνιστεί ο ρόλος της ΑΡΟΕ σε σχέση με τον LDLR, χρησιμοποιήθηκαν επίσης ποντίκια 5xFAD και 5xFAD;Ldlr-/- με αδρανοποιημένο το γονίδιο της ApoE (5xFAD;ApoE-/- και 5xFAD;ApoE-/-;Ldlr-/- αντίστοιχα). Η ανάλυση έδειξε ότι στα ποντίκια με αδρανοποιημένο τον LDLR υπήρξε αύξηση του σχηματισμού αμυλοειδών πλακών καθώς και των επιπέδων του β-αμυλοειδούς (Αβ), ανεξάρτητα από την παρουσία της ΑΡΟΕ. Δεν υπήρξε καμιά διαφορά στα πρωτεϊνικά επίπεδα των καρβοξυτελικών πρωτεολυτικών θραυσμάτων (CTF) της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (ΑΡΡ) γεγονός που υποδηλώνει ότι μειώνεται η απομάκρυνση και όχι η παραγωγή του Αβ. Ανάλυση της φλεγμονώδους αντίδρασης στα ποντίκια αυτά έδειξε μείωση στην αστροκυττάρωση και τη μικρογλοίωση απουσία του LDLR ανεξάρτητα από την παρουσία της ΑΡΟΕ. Για τη μελέτη του ρόλου της προερχόμενης από την περιφέρεια Απολιποπρωτεΐνης Ε στην παθογένεση της νόσου του Alzheimer, κατασκευάστηκαν τα διαγονιδιακά ποντίκια TTRI-huApoE4. Τα ποντίκια αυτά εκφράζουν το γενωμικό αλληλόμορφο ε4 της ανθρώπινης ΑΡΟΕ υπό τον υποκινητή της τρανσθυρετίνης (TTRI), o οποίος εξασφαλίζει έκφραση του διαγονιδίου στο ήπαρ και τα μακροφάγα. Τα TTRI-huApoE4 διασταυρώθηκαν αρχικά με ποντίκια ApoE-/- και στη συνέχεια με το διαγονιδιακό μοντέλο 5xFAD. H ανάλυση έδειξε ότι τα 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- σχηματίζουν περισσότερες αμυλοειδείς πλάκες από τα 5xFAD;ApoE-/- τόσο στο φλοιό όσο και στον ιππόκαμπο. Από ανοσοϊστοχημεία για το Αβ προέκυψε ότι τα 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- ποντίκια, έχουν όμοιο πρότυπο με τα 5xFAD;ApoE-/- ως προς το σχήμα των εναποθέσεων. Αντιθέτως, ως προς τις περιοχές στις οποίες το Αβ εναποτίθεται στα 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/-, το πρότυπο μοιάζει με αυτό των ποντικών 5xFAD που έχουν την ενδογενή ΑΡΟΕ. Ανάλυση της φλεγμονώδους αντίδρασης έδειξε ότι η μικρογλοίωση είναι μειωμένη στα ποντίκια 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου. Επίσης βρέθηκε ότι κύτταρα θετικά για IBA1 (μικρογλοιακά/μακροφάγα) συνεντοπίζονται με την ευρισκόμενη πάνω στις αμυλοειδείς πλάκες ΑΡΟΕ4. Για να διαπιστωθεί εάν αυτά τα κύτταρα προέρχονται από την περιφέρεια, ποντίκια 5xFAD;ApoE-/- δέχτηκαν μεταμόσχευση μυελού των οστών από ποντίκια Tg(CAG-EGFP)10sb/J;TTRI-huApoE4;ApoE που εκφράζουν σε όλα τους τα κύτταρα την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Ανοσοϊστοχημεία για GFP έδειξε ότι στα ποντίκια που υπέστησαν μεταμόσχευση, κύτταρα από την περιφέρεια διαπερνούν τον αιματο-εγκεφαλικό φραγμό και εκφράζουν ΑΡΟΕ4. Επίσης βρέθηκε αύξηση της αντιφλεγμονώδους κυτοκίνης ιντερλευκίνης-10 (IL-10) στα ποντίκια 5xFAD;TTRI-huApoE4;ApoE-/- σε σχέση με τα ποντίκια 5xFAD;ApoE-/-. Στην παρούσα μελέτη, παρουσιάζεται η σημαντικότητα του ρόλου του LDLR στην εναπόθεση του Αβ και στο σχηματισμό των αμυλοειδών πλακών. Καταδεικνύεται, ακόμη, ότι ο LDLR ρυθμίζει τη φλεγμονώδη αντίδραση στον εγκέφαλο των ποντικών με παθολογία τύπου Alzheimer. Επιπρόσθετα, δείχνεται ότι η περιφερική έκφραση της ΑΡΟΕ4 επηρεάζει τόσο το σχηματισμό αμυλοειδών πλακών όσο και τη φλεγμονώδη απόκριση στο διαγονιδιακό μοντέλο με παθολογία τύπου Alzheimer κι έτσι υποδεικνύεται ένας στόχος πιο προσβάσιμος στις φαρμακευτικές αγωγές.