Μελέτη της σχέσης δομής και λειτουργίας της απολιποπρωτεΐνης Ε στον εγκέφαλο

Abstract

Apolipoprotein Ε (apoE) plays a crucial role in lipid transport in circulation and the brain. The apoE4 isoform is a major risk factor for Alzheimer s disease (AD) ApoE4 is susceptible to proteolysis and apoE4 fragments have been found in brains of AD patients. These apoE4 fragments have been hypothesized to be involved in the pathogenesis of AD although the mechanism is not clear. In this thesis we studied the effect of apoE4 fragments apoE4[A(186-299)] and apoΕ4[Δ(166-299)] on amyloid peptide β (Aβ) homeostasis and inflammation in human neuroblastoma SK-N-SH cells. Elisa and fluorescence confocal laser scanning microscopy analysis showed that lipid-free apoE4[A(166-299)] reduces the extracellular levels of Aβ40 and Aβ42 by promoting the uptake of Aβ by SK-N-SH cells. A longer length fragment, apoE4[A(186-299)] or full-length apoE4 failed to elicit this effect. ΑροΕ4[Δ(166-299)] effected a 20% reduction of cellular sphingomyelin levels, as well as changes in cellular membrane micro-fluidity. Following uptake, approximately 50% of Αβ42, but not Αβ40, remained within cells for at least 24h and led to increased formation of reactive oxygen species. Our results provide an association between two early events in the pathogenesis of AD, apoE4 proteolysis and intraneuronal accumulation of Aβ. Western blot and zymography analysis showed that apoE4[A(186-299)], but not apoE4 or apoE4[A(166-299)], leads to increased extracellular levels of matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) in SK-N-SH cells. Similarly, treatment of cells with IL-1β leads to increased extracellular levels of MMP9 and TIMP1. As shown by real time PCR IL-1β gene expression is increased in cells treated with apoE4[A(186-299)], indicating that apoE4[A(186-299)] increases MMP9 and TIMP1 levels by inducing IL-1β gene expression in cells. Overall our findings suggest that specific apoE4 proteolytic fragments can promote Αβ42 accumulation or inflammation in neurons, two events that have been associated with the pathogenesis of AD.

Η απολιποπρωτεῒνη Ε (αποΕ) παίζει σημαντικό ρολό στη μεταφορά λιπιδίων στην κυκλοφορία του αίματος και τον εγκέφαλο. Η ισομορφή αποΕ4 είναι ο σημαντικότερος δείκτης κίνδυνου της νόσου του Alzheimer (AD). Η αποΕ4 είναι επιρρεπής σε πρωτεόλυση και θραύσματα της έχουν εντοπιστεί σε εγκέφαλους ασθενών με AD. Τα θραύσματα της αποΕ4 έχει προταθεί ότι εμπλέκονται στην παθογένεση της AD, αλλά ο μηχανισμός δράσης τους δεν έχει διευκρινιστεί. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε το ρόλο των θραυσμάτων της αποΕ4 αποΕ4[Δ(186- 299)] και αποΕ4[Δ( 166-299)] στην ομοιόσταση του αμυλοειδούς πεπτιδίου β (Αβ) και τη φλεγμονή στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος άνθρωπου SK-N-SH. Ανάλυση με Elisa και συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι η ελεύθερη λιπιδίων αποΕ4[Δ(166-299)] μειώνει τα εξωκυτταρικά επίπεδα των Αβ40 και Αβ42, προάγοντας την πρόσληψη τους από τα κύτταρα SK-N-SH. Αντίθετα, το μεγαλύτερο θραύσμα αποΕ4[Δ(186-299)] και η αγρίου τύπου αποΕ4 δεν είχαν αυτή την επίδραση. Η αποΕ4[Δ(166-299)] οδήγησε σε 20% μείωση των κυτταρικών επίπεδων σφιγγομυελίνης και αλλαγή στη ρευστότητα της πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων. Μετά την πρόσληψη από τα κύτταρα, ποσοστό 50% του Αβ42, αλλά όχι του Αβ40, παρέμεινε στα κύτταρα για τουλάχιστον 24 ώρες και οδήγησε σε αύξηση του σχηματισμού δραστικών οξυγονούχων ενώσεων. Τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα σε δύο αρχικά γεγονότα στην παθογένεση της AD, την πρωτεόλυση της αποΕ4 και τη συσσώρευση του Αβ εντός των νευρώνων. Ανάλυση με ανοσοαποτύπωση και ζυμογραφία έδειξε ότι η αποΕ4[Δ(186- 299)] άλλα όχι η αποΕ4 ή η αποΕ4[Δ(166-299)], οδηγεί σε αύξηση των εξωκυτταρικών επιπέδων της μεταλλοπρωτεάσης της εξωκυττάριας ουσίας 9 (ΜΜΡ9) και του ιστικού αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνάσης 1 (ΤΙΜΡ1) στα κύτταρα SK-N-SH, αντίστοιχα με την επώαση των κυττάρων με IL-1β. Η αύξηση της έκφρασης του γονίδιου της IL-1β σε κύτταρα κατόπιν επώασης με την αποΕ4[Δ(186-299)] που μετρήθηκε με PCR σε πραγματικό χρόνο, υποδεικνύει άτι η αποΕ4[Δ(186-299)] αυξάνει τα επίπεδα της ΜΜΡ9 και του ΤΙΜΡ1 μέσω επαγωγής της έκφρασης του γονίδιου της IL-1β στα κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας συνολικά υποδεικνύουν άτι συγκεκριμένα πρωτεολυτικά θραύσματα της αποΕ4 μπορεί να προάγουν τη συσσώρευση του Αβ42 ή τη φλεγμονή στους νευρώνες δύο γεγονότα που έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση της AD.