Σχέση δομής και λειτουργίας των ανθρώπινων απολιποπρωτεϊνών: αποΕ4 και νόσος Alzheimer

Abstract

Apolipoprotein E4 (apoE4) isoform has consistently emerged as asusceptibility factor for sporadic Alzheimer’s disease (AD), although the exactmechanism is not clear. The elucidation of the pathogenic role of apoE4 in ADrequires the production of large amounts of pure apoE4. For this purpose, wedeveloped a simple procedure for the expression and purification ofrecombinant apoE4. Our approach is based on the expression of athioredoxin-apoE4 fusion construct in bacterial cells and subsequent removalof the fused thioredoxin using the highly specific 3C protease. Our approachresults in rapid, high-yield production of structurally and functionally competent apoE4.A rare apoE4 variant, apoE4[L28P], burdens carriers with added riskfor sporadic AD and may be a useful tool for gaining insight on the role ofapoE4 in disease pathogenesis. Towards this end, we evaluated the effect ofthe L28P mutation on the structural and functional properties of apoE4.ApoE4[L28P], produced with our newly developed approach, was found tohave reduced helical content, to be thermodynamically destabilized and toexpose a larger portion of hydrophobic surface to the solvent. Furthermore,this variant is more prone to proteolysis. When interacting with lipids, apoE4[L28P] formed populations of lipoprotein particles with structural defects. Thestructural perturbations brought about by the mutation were accompanied byaberrant functions associated with the pathogenesis of AD. Specifically,apoE4[L28P] promoted the cellular uptake of extracellular Aβ42 by humanneuroblastoma SK-N-SH cells and primary mouse neuronal cells and led toincreased formation of reactive oxygen species (ROS) that persisted for atleast 24hrs. Finally, lipoprotein particles containing apoE4[L28P] promotedROS formation and reduced SK-N-SH cell viability. Overall, our data suggest that the L28P mutation significantly affects the structure of apoE4 both in solution and in lipoprotein particles and that these effects may underlie apoE4 functional disturbances in neurons that could be associated with AD pathogenesis

Η απολιποπρωτεΐνη Ε4 (αποΕ4) είναι ο σημαντικότερος δείκτης κινδύνου για τη σποραδική νόσο Alzheimer (AD), αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο η αποΕ4 οδηγεί στην AD δεν έχει διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί ο ρόλος της αποΕ4 στην AD απαιτείται καθαρή αποΕ4. Συνεπώς, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο έκφρασης και καθαρισμού ανασυνδυασμένης αποΕ4. Στο πρωτόκολλο αυτό η αποΕ4 εκφράζεται σε βακτηριακά κύτταρα συντηγμένη με ετικέτα θειορεδοξίνης και ακολουθεί η απομάκρυνση της ετικέτας από την υψηλής ειδικότητας 3C πρωτεάση. Η πορεία αυτή οδηγεί στη γρήγορη και σε υψηλά επίπεδα παραγωγή, δομικά και λειτουργικά ορθής αποΕ4. Μια σπάνια φυσικά απαντώμενη μετάλλαξη, η αποΕ4[L28P], έχει συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο για τη σποραδική AD, επιπλέον του γνωστού κινδύνου που επιφέρει η αποΕ4 και μπορεί να αποτελέσει ένα ισχυρό εργαλείο για την κατανόηση του ρόλου της αποΕ4 στην AD. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η επίδραση της μετάλλαξης L28P στις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4. Η αποΕ4[L28P], η οποία παράχθηκε μέσωτ ου νέου πρωτοκόλλου, έχει μειωμένο περιεχόμενο σε α-έλικες, είναι θερμοδυναμικά αποσταθεροποιημένη, εκθέτει μεγαλύτερη επιφάνεια υδρόφοβων περιοχών της στο διαλύτη και παρουσιάζει αυξημένη ευαισθησία στην πρωτεόλυση. Επιπρόσθετα, παρατηρούνται λειτουργικές αλλαγές, αφούη αποΕ4[L28P] προάγει την ενδοκυτταρική συσσώρευση του εξωκυτταρικού Αβ42 σε κύτταρα νευροβλαστώματος SK-N-SH και σε πρωτογενή καλλιέργεια νευρώνων μυών και αυξάνει το σχηματισμό κυτταρικών δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Επίσης, η αποΕ4[L28P] σχηματίζει λιποπρωτεϊνικά σωματίδια με δομικές αλλοιώσεις και λιποπρωτεϊνικά σωματίδια που περιέχουν την αποΕ4[L28P] προωθούν επίσης τον σχηματισμό των ROS και μειώνουν τη βιωσιμότητα των SK-N-SH κυττάρων. Τα παραπάνω αποτελέσματά υποδεικνύουν ότι η μετάλλαξη L28P επηρεάζει σημαντικά τη δομή της αποΕ4 τόσο σε μορφή ελεύθερη λιπιδίων όσο και σε λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Σε αυτές τις αλλαγές μπορεί να οφείλονται οι λειτουργικές διαταραχές που εμφανίζει η αποΕ4 στους νευρώνες και οι οποίες μπορεί να σχετίζονται με την παθογένεση της AD.