Δομικός-λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου LBR

Abstract

LBR is a ubiquitous integral protein of the inner nuclear membrane and was initially characterized by virtue of its ability to associate with nuclear lamin B. This protein is thought to participate in a variety of nuclear functions, including tethering of the nuclear lamina to the nuclear envelope and “trapping” of nuclear components that are involved in chromatin remodeling and transcriptional inactivation. Human LBR is composed of 615 amino acids, comprising a hydrophilic N-terminal domain of ~210 residues that faces the nucleoplasm and is believed to mediate binding to nuclear lamina and peripheral heterochromatin, multiple transmembrane segments homologous to yeast sterol C-14 reductase and a short C-terminal tail. Biocomputing analysis suggests that the N-terminal nucleoplasmic part contains three distinct regions: (a) a small globular domain which spans the first 60 residues and is a putative Tudor domain; (b) a 110- amino acid segment with no apparent sequence kinship to other proteins; and (c) a highly charged 40-residue hinge region that is rich in Arg-Ser dipeptide motifs (RS region). The latter segment has features of a “natively disordered” protein and is punctuated by multiple RSPK1 phosphorylation sites. Tudor domains are 50-70 amino acid modules, named after the synonymous Drosophila protein, which harbors 11 such copies. They were initially thought to be RNA-binding motifs, mainly because they were mostly identified in RNA-binding proteins. However, a combination of sequence- and structure-dependent approaches, has recently shown that Tudor, along with PWWP, chromodomain, MBT and Agenet, comprise a protein structural superfamily, called the ‘Royal family’. The members of this superfamily occur in a variety of chromatin-associated proteins and are thought to originate from a common ancestor. Despite extensive studies in the last years, the exact role of Tudor domains remains elusive, and it is, most likely, quite diverse. Structural studies of the Tudor domains from several proteins provided evidence that methylated arginine or lysine could represent physiological ligands for these modules. In all reported cases of Tudor interactions the modified bulky side-chains of the ligand’s Arg or Lys residues are accommodated by an aromatic cage on the surface ofthe domain, which is highly reminiscent of the one present in several chromodomains and known to comprise the binding site for modified histone tails. Modifications of histones are believed to play a major role in gene regulation and are related, directly or indirectly, with chromatin-remodeling. In an attempt to elucidate the molecular basis of LBR interactions with chromatin and its in situ organization at the nuclear envelope we dissected LBR into structurally-functionally relevant domains and studied their interactions with chromatin components and their role in the oligomerization of the molecule, using a variety of biochemical and biophysical methods. Electron microscopy and analytical ultracentrifugation experiments confirmed the previously suggested oligomerization of LBR and led to an estimation of the mass of the oligomeric particles. Biochemical experiments suggested that the region of LBR responsible for its oligomerization is the RS segment. We also determined the atomic structure of the putative Tudor domain by NMR spectroscopy, and showed that it adopts a β-barrel fold, which is similar to that of all the other members of the Tudor superfamily and is made-up by five β-strands that are organized in two, 3-stranded anti-parallel β-sheets. We also identified an aromatic cluster on the surface of the domain which is reminiscent of the aromatic cages found in several chromodomains and is formed by the side chains of highly conserved aromatic residues. Our biochemical experiments suggested a specific interaction between LBR-Tudor and non-assembled H3 that is mediated by the core domain of H3 and does not depend on H3 modifications. This work also indicated that the aromatic cluster of LBR-Tudor does not exhibit the “binding pocket” features of other Tudor domains, at least as far as its interaction with H3 is concerned. Mapping experiments of the binding interface between LBR-Tudor and H3 pointed to an extended surface on one side of the domain, which is formed by residues from both of its β-sheets and not by the residues of the aromatic cluster. Furthermore, biochemical binding assays using the other parts of LBR suggested that the stable interaction between LBR and chromatin is mediated by its RS region, which binds not only to isolated H3 and H4 histones, but also to fully assembled nucleosomes. Based on our results and considering the highly dynamic nature of chromatin, the interaction of LBR with histones could involve temporally distinct steps. Binding of LBR-Tudor to unmodified and non-assembled H3 could result either from a transient interaction between LBR and H3 at the very early stages of peripheral chromatin assembly or from an interaction with a chromatin state ‘in transition’, in which H3 is exposed and not modified or even not folded yet, while the RS region could serve as a “platform” for the assembly of the Η3/Η4 tetramer. This scenario is compatible with the presumed role of nuclear envelope as a platform for peripheral heterochromatin assembly and chromatin remodeling.

Ο υποδοχέας της λαμίνης B (Lamin Β Receptor, LBR) είναι μία συντηρημένη σε όλους τους ανώτερους οργανισμούς πρωτεΐνη της έσω πυρηνικής μεμβράνης. Αναγνωρίστηκε από την ικανότητά της να συνδέεται στη λαμίνη Β. Είναι πλέον γνωστό ότι ο LBR συμμετέχει σε μεγάλα πολυδύναμα σύμπλοκα, τα οποία συμμετέχουν στον επανασχηματισμό του πυρηνικού φακέλου στο τέλος της μίτωσης, συνδέουν τον πυρηνικό φάκελο και την πυρηνική λάμινα με την περιφερική ετεροχρωματίνη κατά τη μεσόφαση και πιθανώς λειτουργούν ως ‘παγίδες συγγένειας’ για συστατικά του πυρήνα που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην ενεργοποίηση-απενεργοποίηση της μεταγραφής. Ο ανθρώπινος LBR περιέχει 615 αμινοξέα και αποτελείται από ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο που κείτεται προς το πυρηνόπλασμα και πιθανολογείται ότι ευθύνεται για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης, από πολλαπλά διαμεμβρανικά τμήματα που παρουσιάζουν ομολογία με αναγωγάσες των στερολών και από ένα μικρό καρβοξυτελικό άκρο. Αναλύσεις με εργαλεία βιοπληροφορικής έδειξαν ότι το αμινοτελικό άκρο του LBR αποτελείται από τρεις διακριτές περιοχές: α) από ένα domain που με βάση την αλληλουχία του μπορεί να ανήκει στην κατηγορία των Tudor domains (αμινοξέα 1-60), β) ένα τμήμα 110 αμινοξέων που δεν παρουσιάζει ομοιότητες στην αλληλουχία του με άλλες πρωτεΐνες, και γ) μία ισχυρά φορτισμένη περιοχή 40 αμινοξέων, πλούσια σε διπεπτίδια σερίνης-αργινίνης, η οποία υπόκειται σε φωσφορυλιώσεις από τις κινάσες SRPK1 και cdc2 και έχει όλα τα χαρακτηριστικά των ‘intrinsically unstructured” πρωτεϊνών. Τα Tudor domains είναι σχετικά μικρά (50-70 αμινοξέα) πρωτεϊνικά μοτίβα, τα οποία πήραν το όνομά τους από τη πρωτεΐνη Tudor της drosophila. Επειδή βρέθηκαν αρχικά κυρίως σε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούσαν με RNA, θεωρήθηκαν μοτίβα που συνδέονται σε RNA. Παρόλα αυτά, δεν υπήρξαν έως τώρα πειραματικές ενδείξεις που να επιβεβαιώνουν τη παραπάνω υπόθεση. Πρόσφατα, μετά από εκτεταμένη σύγκριση πρωτεϊνικών αλληλουχιών και δομών, φάνηκε ότι τα Tudor μαζί με άλλα μοτίβα (PWWP, chromodomain, ΜΒΤ, Agenet) που αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη σχηματίζουν μια υπεροικογένεια μοτίβων με κοινά δομικά χαρακτηριστικά. Παρά τις εκτεταμένες μελέτες των τελευτών ετών ο ακριβής ρόλος των Tudor domains παραμένει αδιευκρίνιστος. Οι έως τώρα δομικές μελέτες αναφέρουν ότι πιθανώς τα συγκεκριμένα μοτίβα αλληλεπιδρούν με πρωτεϊνικούς παράγοντες και υπάρχουν ενδείξεις ότι μεθυλιωμένες λυσίνες ή αργινίνες αποτελούν τους φυσιολογικούς προσδέτες τους. Σε όλες τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν αναδείχθηκε ο ρόλος του αρωματικού κλωβού ως δομικό χαρακτηριστικό στην επιφάνεια των Tudor domains στον οποίο εισέρχονται τα μεθυλιωμένα κατάλοιπα, παρόμοια με το τρόπο αναγνώρισης των τροποποιημένων ιστονικών αμινοτελικών ουρών από τα chromodomains. Οι τροποποιήσεις των ιστονών θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση, καθώς σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με τη διαδικασία αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Σε μία προσπάθεια να διερευνήσουμε σε μοριακό επίπεδο τις αλληλεπιδράσεις του LBR με τη χρωματίνη και τον τρόπο οργάνωσης του μορίου του, μελετήσαμε ξεχωριστά τα τρία διακριτά τμήματα της αμινοτελικής του περιοχής. Αρχικά, υπολογίστηκε σε ατομική λεπτομέρεια η τρισδιάστατη δομή του Tudor domain με φασματοσκοπία NMR και μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του με βιοχημικές και βιοφυσικές τεχνικές. To Tudor domain του LBR αναδιπλώνεται σε μία δομή β-βαρελιού, παρόμοια με αυτή που αποκτούν και τα άλλα μέλη της Tudor υπεροικογένειας. Τα αποτελέσματα των βιοχημικών δοκιμών με πυρηνικά εκχυλίσματα, φυσικές και ανασυνδυασμένες ιστόνες έδειξαν ότι το Tudor domain του LBR αλληλεπιδρά ειδικά με το κεντρικό τμήμα της ιστόνης Η3, ανεξάρτητα από τη παρουσία τροποποιήσεων. Η συγκεκριμένη αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα όταν η Η3 βρίσκεται ελεύθερη, ενώ δεν παρατηρείται όταν η Η3 βρίσκεται ενσωματωμένη στο νουκλεόσωμα, κάτι που υποδεικνύει μία παροδική αλληλεπίδραση μεταξύ LBR και Η3 σε πρωταρχικά στάδια του σχηματισμού της περιφερικής χρωματίνης ή μία αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη να βρίσκεται σε στάδιο αναδιοργάνωσης όπου η Η3 δεν έχει τροποποιηθεί και πιθανώς ούτε έχει αναδιπλωθεί ακόμα. Τα δομικά χαρακτηριστικά της παραπάνω αλληλεπίδρασης δείχνουν ότι το Tudor domain του LBR αλληλεπιδρά με την Η3 διαφορετικά από το καθιερωμένο τρόπο που χρησιμοποιούν άλλα Tudor domains, τα οποία αναγνωρίζουν μεθυλιωμένα κατάλοιπα. Ο τρόπος αναγνώρισης της Η3 από το Tudor domain του LBR δείχνει ότι στην αλληλεπίδραση συμμετέχουν αμινοξέα που βρίσκονται και στις δύο β-πτυχωτές επιφάνειες και σχηματίζουν μία εκτεταμένη επιφάνεια στη μία πλευρά του μορίου. Βιοχημικές δοκιμές χρησιμοποιώντας και τις άλλες περιοχές του αμινοτελικού άκρου του LBR έδειξαν ότι η περιοχή με τα SR διπεπτίδια παίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση του LBR με τη χρωματίνη, καθώς συνδέεται σε απομονωμένα νουκλεοσώματα και σε απομονωμένες ιστόνες Η3 και Η4. Η περιοχή RS φάνηκε επίσης να ευθύνεται για τον ολιγομερισμό του LBR, καθώς μπορεί και αλληλεπιδρά με ολόκληρη τη φυσική πρωτεΐνη αλλά και με το ανασυνδυασμένο αμινοτελικό τμήμα της. Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία και αναλυτική υπερφυγοκέντρηση επιτεύχθηκε η αναπαράσταση των ολιγομερών σωματιδίων του LBR και η εκτίμηση του μεγέθους τους.