Ενζυμικά σύμπλοκα της πυρηνικής μεμβράνης που ρυθμίζουν τη γενετική έκφραση και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων βλαστικών κυττάρων: η σημασία της φωσφορυλίωσης της ιστόνης H3 και ο ρόλος της κινάσης Haspin

Abstract

Nuclear envelope vesicles associated with fragments of peripheral heterochromatin were found to contain multiple histone-modifying activities. One of these activities (T3K) binds specifically to heterochromatin protein 1 and phosphorylates histone H3 at threonine 3 (H3T3phos) in vitro. We have demonstrated that apart from phosphorylating histone H3, T3K also possesses nucleoside diphosphate (NDP)-kinase activity and transfers phosphate groups from ATP to GDP in vitro. Assessing the existence of histone H3T3phos in vivo, we raised specific polyclonal antibodies and showed that the phosphorylation occurs during mitosis. H3T3phos exhibits a distinct spatio-temporal pattern, initiating at peripheral sites of the prophase nucleus, then focusing at the centric regions of metaphase chromosomes and, finally, “translocating” to the distal segments of segregating chromatids yielding a fleeing “fingertip” pattern that disappears in telophase. Similar H3T3phos patterns were observed in a variety of cell types of mammalian and plant origin, suggesting a high degree of conservation and an important role of the relevant modification. However, in contrast to other cells, the distribution of the modification in E14 mouse embryonic stem cells grown in the presence/absence of the LIF factor exhibited remarkable variation, suggesting that it is dynamically modulated during cytodifferentiation. To explore the relationship of H3T3phos with other modifications in the H3 molecule, we have immunoisolated native modified histone and examined its overall modification status by western blotting and mass spectrometry. As it turns out, H3T3phos is part of a more complex modification signature that also includes trimethylation of lysine-4 and dimethylation of arginine-8. From the initials of the modifications (phosphorylation-methylation-methylation) we termed this combinatorial modification the ‘PMM signature’. By raising specific polyclonal antibodies we were also able to confirm the existence of the PMM mark in vivo. PMM-marked chromatin exhibits the same spatio-temporal pattern as described for H3T3phos-marked chromatin. Moreover, in double immunolabelling experiments, a close spatial relationship between PMM/H3T3phos-containing chromatin and the centromere in intact mitotic cells, unfixed metaphase spreads and extended chromatin fibers was observed, suggesting that the modified chromatin resides in the inner centromeric zone. Finally, by ectopic expression of the enzyme responsible for H3T3phos (Haspin), we were able to reproduce the perinuclear prophase pattern observed during interphase. This finding suggests that the modification is triggered by selective activation of the Haspin kinase in the neighbourhood of the nuclear envelope. On the other hand, displacement of the PMM foci from centric to distal sites can be induced by partial dephosphorylation, indicating that the changes observed at the metaphase-anaphase transition are due to modification-dependent chromatin rearrangements. Consistent with this interpretation, PMM sites are organized as dispersed “islets” in extended chromatin fibers and as single, juxta-centromeric clusters in intact chromosomes, suggesting that the combinatorial modification of histone H3 represents an editable, chromatin folding determinant.

Πυρηνικοί φάκελοι και τμήματα ετεροχρωματίνης που συνδέονται ισχυρά στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, περιλαμβάνουν πολλές ενεργότητες ενζύμων που τροποποιούν τις ιστόνες. Μια από αυτές τις ενεργότητες, προσδένεται ειδικά στην ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 και φωσφορυλιώνει την ιστόνη Η3 στην θρεονίνη 3 in vitro. Δείξαμε ότι η Τ3Κ, εκτός από την φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3, φέρει ενεργότητα NDP (Nucleoside Diphosphate) κινάσης και μεταφέρει φωσφορικές ομάδες από το ATP στο GDP in vitro. Διερευνώντας την ύπαρξη της H3T3phos in vivo, παρασκευάστηκαν ειδικά πολυκλωνικά αντισώματα και αποδείξαμε ότι η τροποποίηση αυτή υφίσταται κατά την διάρκεια της μίτωσης. Η Η3Τ3phos έχει ένα ξεχωριστό χωροχρονικό πρότυπο κατανομής. Εμφανίζεται αρχικά στην πρόφαση, μετατοπίζεται στις κεντρομεριδιακές περιοχές των μεταφασικών χρωμοσωμάτων, κατόπιν ‘αναστρέφεται’ στα ακραία τμήματα των αποχωρισμένων αδελφών χρωματίδων, και τέλος, εξαλείφεται στην τελόφαση. Χρώσεις διαφόρων κυτταρικών τύπων έδωσαν πανομοιότυπο πρότυπο κατανομής, υποδεικνύοντας ότι η τροποποίηση είναι συντηρημένη, αποτελεί χαρακτηριστικό της μιτωτικής κατάστασης και ακολουθεί αυστηρά ρυθμιζόμενη κινητική. Παρόλα ταύτα, σε αντίθεση με προηγούμενους κυτταρικούς τύπους, η κατανομή της H3T3phos σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού (Ε14) παρουσίασε μια ποικιλομορφία φαινοτύπων, και ένδειξη ότι μεταβάλλεται δυναμικά ανάλογα με την κυτταρική διαφοροποίηση. Για να διερευνηθεί η συσχέτιση της H3T3phos με άλλες τροποποιήσεις στο μόριο της ιστόνης Η3, ανοσοαπομονώσαμε την τροποποιημένη ιστόνη και εξετάσαμε το πλαίσιο των τροποποιήσεων στο οποίο υφίσταται, με ανοσοαποτύπωση κατά western και φασματοσκοπία μάζας. Ανάλυση αυτών των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η H3T3phos αποτελεί μέρος ενός συνδυασμού τροποποιήσεων που συμπεριλαμβάνει την τριμεθυλίωση στη λυσίνη-4 και τη διμεθυλίωση στην αργινίνη-8. Από τα αρχικά των τροποποιήσεων (phosphorylation-methylation-methylation), το παραπάνω συνδυαστικό μοτίβο ονομάστηκε PMM ‘υπογραφή’. Παρασκευάζοντας πολυκλωνικά αντισώματα μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε την ύπαρξη του PMM συνδυασμού in vivo. Συσχετίζοντας τις PMM/Η3Τ3phos-εμπλουτισμένες περιοχές,παρατηρήσαμε ότι η χρωμοσωμική κατανομή και το πλαίσιο των ιστονικών τροποποιήσεών τους ήταν πανομοιότυπες. Επιπλέον, διπλές χρώσεις κυττάρων, διασπορών μεταφασικών χρωμοσωμάτων και εκτεταμένων ινών χρωματίνης αποκάλυψαν την γειτονία των PMM/H3T3phos περιοχών με κεντρομεριδιακές περιοχές, υποδεικνύοντας ότι η τροποποιημένη χρωματίνη εντοπίζεται στην ενδότερη περιοχή του κεντρομεριδίου. Επεκτείνοντας τη μελέτη, προκαλέσαμε την έκτοπη έκφραση της H3T3phos σε μεσοφασικά κύτταρα, υπερεκφράζοντας το καταλυτικό τμήμα του ενζύμου που την φωσφορυλιώνει (Haspin). Σε αυτά τα κύτταρα παρατηρήσαμε ένα περιπυρηνικό πρότυπο κατανομής των PMM/P3-περιοχών στη μεσόφαση, όμοιο με αυτό που παρατηρείται σε φυσιολογικάπροφασικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η τροποποίηση προκαλείται από επιλεκτική ενεργοποίηση της κινάσης Haspin στις περιοχές που γειτονεύουν με τον πυρηνικό φάκελο. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η μετατόπιση των PMM/Η3Τ3phos εστιών από τις κεντρομεριδιακές σε πιο απομακρυσμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων μπορεί να προκληθεί με μερική αποφωσφορυλίωση. Βάσει αυτού του ευρήματος, προτείνουμε ότι οι αλλαγές που παρατηρούνται στη μετάβαση από την μετάφαση στην ανάφαση οφείλονται σε χρωματινικές ανακατατάξεις που εξαρτώνται από τον βαθμό φωσφορυλίωσης. Σε συμφωνία με αυτήν την ερμηνεία, ανιχνεύσαμε τις PMM/Η3Τ3phos περιοχές να οργανώνονται ως διασκορπισμένες “νησίδες” στις εκτεταμένες ίνες χρωματίνης και ως ενιαίες, κεντρομεριδιακές ‘συστάδες’ στα ακέραια χρωμοσώματα. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν στην ιδέα ότι οι παραπάνω συνδυαστικές τροποποιήσεις της ιστόνης H3 αποτελούν έναν ‘επεξεργάσιμο’ παράγοντα που καθορίζει την αναδίπλωση της χρωματίνης.