Novel insights into the role of nitric oxide and hydrogen sulfide in myocardial protection

Abstract

Aim: We sought to evaluate the role and the underlying molecular mechanisms of endogenous produced or exogenous administrated gasotransmitters, NO and H₂S, on i) the pathophysiology of myocardial ischemia (I)- reperfusion (R) injury; ii) PostC mimicking effects in myocardial infarction and iii) their physiological role in cigarette smoking (CS). The aims were assessed by performing four separate experimental studies. Methods and Results: In the first study oxidative stress injury by H₂O₂ in cardiomyocytes or in vivo myocardial I-R injury increased PYK2 activity and eNOS phosphorylation on both the inhibitory site Y656 and on the activator site S1176. Activity assays demonstrated that Y657 exerts a dominant effect over S1176. Pharmacological blockade of PYK2 alleviated eNOS inhibition and reduced myocardial infarct size in wild-type, but not in eNOS KO mice. In the second and third study low dose IV NTG and NaHS reduced infarct size in anesthetized male rabbits without affecting haemodynamics. However differences were detected in the downstream pathways. On one hand NTG’s protection was abolished by PI3K and NOS inhibition and NTG had no effect on infarct size in eNOS KO mice. Moreover, NTG failed to increase cardiac cGMP levels while PKG inhibition did not reverse NTG’s infarct limiting effects. Mechanistically, NTG protected through a CypD-dependent manner as it failed to confer additional protection in hearts from CypD KO mice. Interestingly, NTG minimized nitro-oxidative stress due to an eNOS mediated mechanism. On the other hand NOS inhibition did not alter the effect of NaHS in rabbit hearts; however, genetic or pharmacological inhibition of eNOS abolished the infarct-limiting effect of NaHS in mice. NaHS increased cardiac cGMP levels and PKG inhibition abrogated its protective effects. In addition, it enhanced phosphorylation of phospholamban (PLN), in a PKG-dependent manner and did not exert cardioprotection in PLN KO mice. In the fourth study exposure of mice to CS increased blood pressure and up regulated the NOS/sGC/cGMP pathway whilst decreased H₂S generating enzymes expression. Exposure to CS did not increase the infarction compared to the room air (RA)-exposed group. PreC but not PostC application was beneficial for both CS and RA vs non-conditioned animals. PreC preserved its effects in mice exposed to CS, as it does not affect the cardioprotective signaling; in contrast to PostC. Conclusions: i) PYK2 is a pivotal regulator of eNOS function in the pathophysiology of myocardial infarction; ii) Exogenous administration of NO and H₂S donors reduces myocardial infarct size. The two gaseous molecules act different in the upstream pathways, but both preserve mitochondrial integrity and rescue cardiomyocytes from death and iii) CS is a new comorbidity that blunts PostC beneficial effects in the myocardium due to impaired activation of the Akt/eNOS/cGMP axis that occurs in parallel to enhanced oxidative stress.

Σκοπός: Να διερευνήσουμε το ρόλο των ενδογενών παραγόμενων και εξωγενώς χορηγούμενων αέριων διαβιβαστών, NO και H₂S, i) στη παθοφυσιολογία του εμφράγματος του μυοκαρδίου, ii) στην ικανότητά τους να μιμούνται το PostC και iii) το φυσιολογικό τους ρόλο στο κάπνισμα. Οι σκοποί προσεγγίστηκαν με την διενέργεια τεσσάρων διακριτών μελετών. Μέθοδοι και Αποτελέσματα: Στην πρώτη μελέτη η επαγωγή οξειδωτικού στρες σε καρδιομυοκύτταρα ή η in vivo επαγωγή εμφράγματος του μυοκαρδίου ενεργοποίησε την PYK2 και φωσφορυλίωσε την eNOS τόσο στην ανασταλτική Y656 όσο και στη θέση ενεργοποίησης S1176. Με δοκιμασίες ενεργότητας η θέση Y657 αποδείχθηκε κυρίαρχη σε σχέση με τη θέση S1176. Η φαρμακολογική αναστολή της PYK2 ανέστρεψε την αναστολή, της eNOS και μείωσε την έκταση του εμφράγματος στους μύες άγριου τύπου, αλλά όχι στους eNOS KO μύες. Στη δεύτερη και τρίτη μελέτη η χορήγηση Νιτρογλυκερίνης και NaHS μείωσαν την έκταση του εμφράγματος σε in vivo κονίκλους. Ωστόσο η μοριακή σηματοδότηση των δύο μορίων διαφοροποιήθηκε. Η καρδιοπροστατευτική δράση της νιτρογλυκερίνης ανατράπηκε κατόπιν αναστολής των PI3K και NOS ενώ η χορήγησή της δε μείωσε την έκταση του εμφράγματος σε μύες eNOS KO. Επιπρόσθετα, η Νιτρογλυκερίνη δεν αύξησε τα επίπεδα του καρδιακού cGMP ενώ η αναστολή της PKG δεν ανέτρεψε την προστατευτική της δράση. Μηχανιστικά, η Νιτρογλυκερίνη προστάτευσε μέσω ενός εξαρτώμενου από την CypD τρόπου καθώς δεν οδήγησε σε επιπρόσθετη προστασία σε CypD KO μύες. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι η δράση της σχετίστηκε με μία εξαρτώμενη από την eNOS μείωση του νιτρο-οξειδωτικού στρες. Αντίθετα η αναστολή των NOS δεν επηρέασε την ευεργετική δράση του NaHS στην ομάδα των κονίκλων, ωστόσο, στους μύες η γενετική ή φαρμακολογική αναστολή της eNOS ανέτρεψε τη δράση του NaHS. Το NaHS αύξησε τα καρδιακά επίπεδα του cGMP και η αναστολή της PKG ανέστρεψε την προστατευτική του δράση. Επιπρόσθετα, το NaHS ενεργοποίησε τη φωσφολαμβάνη (PLN), με τρόπο εξαρτώμενο από την PKG και δεν μείωσε την έκταση του εμφράγματος σε μύες PLN KO. Στην τέταρτη μελέτη η έκθεση μυών σε καπνό τσιγάρου αύξησε την αρτηριακή πίεση και ενεργοποίησε το μονοπάτι NOS/sGC/cGMP ενώ μείωσε την έκφραση των ενζύμων που παράγουν H2S. Η έκθεση στο κάπνισμα δεν αύξησε την έκταση του εμφράγματος σε σχέση με την ομάδα έκθεσης σε αέρα δωματίου. Η εφαρμογή του PreC αλλά όχι του PostC ήταν αποτελεσματική στους μύες υπό έκθεση σε καπνό τσιγάρου. Το PreC διατήρησε την καρδιοπροστατευτική του δράση καθώς δεν επηρέασε την σηματοδότηση επιβίωσης σε αντίθεση με το PostC. Συμπεράσματα: i) η PYK2 αποτελεί κυρίαρχο ρυθμιστή της eNOS στο έμφραγμα του μυοκαρδίου; ii) Η εξωγενής χορήγηση δοτών ΝΟ και H₂S μειώνει την έκταση του εμφράγματος. Οι δύο αέριοι διαβιβαστές λειτουργούν με διακριτό μοριακό μηχανισμό, ωστόσο αμφότεροι διατηρούν την καρδιακή μιτοχονδριακή ακεραιότητα και iii) Το κάπνισμα αποτελεί μία νέα συννοσυρότητα η οποία αναστέλλει την ευεργετική δράση του PostC στο μυοκάρδιο επιδρώντας στα σηματοδοτικά μονοπάτια διάσωσης.