Idas, μια νέα πρωτεΐνη συγγενική του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin: λειτουργική μελέτη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ζωικά μοντέλα

Abstract

Geminin is a bifunctional protein which participates both in cell cycle and development. Geminin regulates the cell cycle by directly binding and inhibiting the licensing factor Cdt1, thus ensuring once per cell cycle DNA replication. Geminin also interacts with transcriptional regulators of differentiation and chromatin remodelling factors, thus affecting cell cycle decisions. It has been proposed that Geminin’s balanced interactions are implicated in proliferation-differentiation decisions. Geminin possesses s a central coiled coil region which mediates the majority of Geminin’s interactions. Herein, we describe a novel protein named Ιdas which exhibits homology to Geminin’s coiled coil. In previous studies from our lab it was shown that Idas and Geminin interact in cells when ectopically expressed. In this study we generated and used a specific polyclonal antibody against Idas to study endogenous Geminin:Idas interaction. Moreover we functionally characterized the Geminin:Idas complex in DNA replication. Using a Xenopus in vitro licensing system it was shown that Geminin, when in complex with Idas loses it’s inhibitory activity on DNA replication. Idas inhibitory function over Geminin was also revealed by ectopic expression of Idas in cell lines: Idas overexpression causes DNA over-replication a phenotype rescued by Geminin’s concomitant ectopic expression. To better characterize Ιdas’s function, we depleted Idas from cells. Idas ablation affects cell cycle progression and cells accumulate in S phase. Idas depleted cells show a reduced ability to normally proceed through the cell cycle to Mitosis and G1. To study Idas protein levels throughout the cell cycle we generated a cell line stably expressing IdasGFP. In this cell line Idas protein levels were found to be reduced in anaphase of Mitosis and increase again upon entry to G1. The importance of Idas for normal passage through Mitosis was revealed by ectopic expression experiments: An increased number of cells with abnormal multipollar spindle formation was evident when Idas was ectopically expressed. By searching for other proteins with homology to Idas and Geminin, we found another genomic locus that encodes for a protein that shares two homology regions with Idas: the coiled coil region and the C-terminal region. This protein is the closest prologue of Idas in vertebrates and we named it Lynkeas (Lynkeas being the twin brother of Idas in ancient Greek mythology). Lynkeas interacts with Geminin and Idas but not Cdt1. The above suggest that competing interactions between Idas, Lynkeas Geminin and Cdt1 may provide a switch regulating the timing of DNA replication. Moreover, we studied Idas during differentiation and development. Idas expression pattern was assessed during mouse embryonic development and compared to the expression pattern of Idas prologue, Lynkeas. Idas and Lynkeas exhibit a specific and overlapping expression pattern in the developing ciliated epithelia and specifically in the choroid plexus and respiratory epithelium, indicating their possible implication in the differentiation of motile cilia. The function of Idas was also determined in other systems and model organism. Endogenous Idas was studied in total extracts from Xenopus eggs where it was shown to interact with Geminin. Danio rerio was used as a model organism to study Idas’s function during development. We identified the orthologue of Idas in Danio rerio and examined it’s expression pattern during embryogenesis of Danio rerio. Danio rerio was also used as a heterologous system in preliminary studies for the ectopic expression of human Idas and it’s mutanst during zebrafish development. The above results indicate that Geminin, Idas and Lynkeas constitute a superfamily of proteins with similar coiled coils. Through balanced interactions Geminin, Idas and Lynkeas participate in cell cycle and cell differentiation and could balance these two processes.

Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο καθώς συμμετέχει τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και την κυτταρική διαφοροποίηση. Στον κυτταρικό κύκλο αλληλεπιδρά και απενεργοποιεί τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, εξασφαλίζοντας με αυτόν τον τρόπο ότι το γονιδίωμα θα αντιγραφεί μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Ο ρόλος της Geminin στην κυτταρική διαφοροποίηση εγκαθιδρύεται από πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με μεταγραφικούς παράγοντες και παράγοντες αναδιάταξης της χρωματίνης. Έχει προταθεί ότι η Geminin, μέσα από ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις, δρα σαν ρυθμιστής της κυτταρικής απόφασης για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Βασικό δομικό χαρακτηριστικό της Geminin αποτελεί ένα κεντρικά τοποθετημένο σπειροειδές σπείραμα το οποίο είναι απαραίτητο για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις της Geminin. Στην παρούσα εργασία περιγράφουμε τη λειτουργία μιας νέας πρωτεΐνης με σημαντική ομολογία για το σπειροειδές σπείραμα της Geminin, την οποία ονομάσαμε Idas (Ξάδελφος των Διόσκουρων (Gemini) στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Από προηγούμενες μελέτες μας γνωρίζαμε ότι ο Idas αλληλεπιδρά με τη Geminin και όχι με το Cdt1, σε επίπεδο εξωγενώς εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Δείχτηκε ότι η ενδογενής Geminin και ο ενδογενής Idas αλληλεπιδρούν στα κύτταρα και χαρακτηρίστηκε η λειτουργική δράση του συμπλόκου Geminin:Idas κατά την αντιγραφή του DNA. Χρησιμοποιώντας ένα ελεύθερο κυττάρων σύστημα αδειοδότησης στο Xenopus δείχθηκε ότι όταν ο Idas είναι σε σύμπλοκο με τη Geminin, η Geminin χάνει την ανασταλτική της δράση επί της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Η ανασταλτική δράση του Idas επί της Geminin φάνηκε και σε πειράματα in vivo σε κυτταρικές σειρές, στα οποία η υπερέκφραση του Idas οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γενετικού υλικού, φαινότυπος ο οποίος διασώζεται από ταυτόχρονη υπερέκφραση της Geminin. Για τον καλύτερο χαρακτηρισμό της δράσης του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, έγινε απoσιώπηση της έκφρασης του σε κύτταρα σε καλλιέργεια. Απουσία έκφρασης του Idas παρεμποδίζεται η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου καθώς αυξάνεται σημαντικά ο πληθυσμός των κυττάρων που βρίσκονται σε φάση S. Τα κύτταρα στα οποία απενεργοποιείται η έκφραση του Idas αδυνατούν να ολοκληρώσουν ορθά τη φάση S και να προχωρήσουν στη μίτωση και τη G1 που ακολουθεί. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση μίας σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς. Βρέθηκε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Idas μειώνονται κατά την ανάφαση της μίτωσης και επανέρχονται νωρίς με την είσοδο στη G1. H σημασία του Idas για τη σωστή διέλευση από τη μίτωση φαίνεται από πειράματα υπερέκφρασής του στα οποία παρατηρείται αυξημένος αριθμός κυττάρων με ανώμαλου σχήματος πολύ-πολικές μιτωτικές ατράκτους. Στην προσπάθεια για εύρεση και άλλων πρωτεϊνών με ομολογία για τoν Idas και τη Geminin, εντοπίσαμε ένα νέο γενετικό τόπο ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη που αποτελεί το κοντινότερο παράλογο του Idas στα σπονδυλωτά καθώς μοιράζεται δύο περιοχές ομολογίας με τον Idas, στο σπειροειδές σπείραμα και στο καρβολυτελικό άκρο των πρωτεϊνών. Λόγω αυτής της ομοιότητας ονομάσαμε την πρωτεΐνη Lynkeas (Δίδυμος αδελφός του Idas στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Ο Lynkeas αλληλεπιδρά με τον Idas και τη Geminin αλλά όχι με το Cdt1. Τα παραπάνω δεδομένα προτείνουν ότι ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Geminin, Idas και Lynkeas είναι πιθανό να ρυθμίζουν χρονικά την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής. Παράλληλα με τη μελέτη της δράσης του Idas στον κυτταρικό κύκλο έγινε μελέτη της πιθανής εμπλοκής του στη διαφοροποίηση με τη χρήση οργανισμών μοντέλων. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασής του σε τομές εμβρύων μυός και συγκρίθηκε με αυτό του παραλόγου του Lynkeas. Oι Ιdas και Lynkeas εμφανίζουν ένα ειδικό και σημαντικά αλληλεπικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης σε αναπτυσσόμενα κροσσωτά επιθήλια όπως το αναπνευστικό και του χοριοειδούς πλέγματος, μαρτυρώντας την πιθανή εμπλοκή τους στη διαφοροποίησή τους. Προκαταρκτικές μελέτες του Idas έγιναν και σε άλλα συστήματα και οργανισμούς μοντέλα. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από αυγά Xenopus επιβεβαιώθηκε η αλληλεπίδραση του Ιdas με τη Geminin. Επίσης, εντοπίστηκε και μελετήθηκε η έκφραση του ορθολόγου του Idas στον ιχθύ Danio rerio. Τέλος, έμβρυα Danio rerio χρησιμοποιήθηκαν σαν ετερόλογο σύστημα για προκαταρκτική μελέτη in vivo της υπερέκφρασης ανθρώπινης πρωτεΐνης Idas και μεταλλαγμένων μορφών αυτής. Τα παραπάνω αποτελέσματα μαρτυρούν ότι η Geminin, o Idas και o Lynkeas ανήκουν σε μία υπεροικογένεια η οποία αποτελείται από πρωτεΐνες με όμοια σπειροειδή σπειράματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin, μέσα από ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις συμμετέχουν στη ρύθμιση τόσο του κυτταρικού κύκλου όσο και της κυτταρικής διαφοροποίησης και πιθανά στο συντονισμό αυτών των δύο διαδικασιών.