Ρόλος της τουμπουλίνης και επίδραση ταξανών και παραγώγων τους στην οργάνωση, λειτουργικότητα και δυναμική του πυρηνικού φακέλου

Abstract

Microtubules are composed of α,β-tubulin heterodimers and are involved in the organization and function of eukaryotic cells. Although tubulin is considered as a cytoplasmic protein, there are reports supporting the presence of tubulin in nuclei of cultured animal cells. We therefore investigated, using immunofluorescence and transient transfection experiments, the mechanism that regulates the sub-cellular localization of tubulin in human carcinoma cell lines. Our results suggest that soluble tubulin is accumulated in the nucleus by its interaction with nuclear components and is exported in the cytoplasm by an active mechanism, which is partially dependent on exportin-1. We have previously shown that binding of soluble tubulin to the nuclear envelope inhibits the association of heterochromatin protein 1 (HP1) with the nuclear envelope. Therefore, we investigated with pull down and overlay blot experiments the interaction of tubulin with nuclear envelope proteins and we found that it binds in a specific manner to histone H3 and inhibits binding of H3 to all HP1 variants and LBR. Moreover, it prevents formation of the multi-component complex consisting of LBR, HP1 and core histones and, therefore, might act as a regulator for the association/dissociation of HP1-enriched heterochromatin to the nuclear envelope. Paclitaxel is an anticancer drug that binds to tubulin and is widely used in the treatment of human carcinomas. A disadvantage of this drug is the low solubility in water. In this work we used analogues in which multiple copies of paclitaxel were covalently bound to synthetic carriers Ac-[Lys-Aib-Cys(CH₂CO-2'-paclitaxel)]n-NH₂, n=2, 3, 4) aiming the improvement of the water solubility. We found with MTT, flow cytometry and immunofluorescence assays that Ac-[Lys-Aib-Cys(CH₂CO-2'-paclitaxel)]₄-NH2 inhibited the proliferation of cancer cells more potently than other synthetic analogues and paclitaxel. Moreover, the effectiveness of Ac-[Lys-Aib-Cys(CH₂CO-2'-paclitaxel)]₄-NH2 on cell cycle arrest at G2/M phase and the production of multinucleated cells which often presented nuclear envelope discontinuity, was greater compared to paclitaxel. In conclusion, our results indicate an improved biological activity of the synthetic analogue, compared to paclitaxel.

Οι μικροσωληνίσκοι σχηματίζονται από ετεροδιμερή α,β-τουμπουλίνης και διαδραματίζουν σημαντικό οργανωτικό και λειτουργικό ρόλο στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Αν και θεωρείται κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν την ύπαρξη τουμπουλίνης στον πυρήνα ζωικών κυττάρων. Ως εκ τούτου μελετήσαμε με πειράματα ανοσοφθορισμού και παροδικής επιμόλυνσης, το μηχανισμό που ρυθμίζει την υποκυτταρική κατανομή της τουμπουλίνης σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τουμπουλίνη συσσωρεύεται στον πυρήνα αλληλεπιδρώντας με πυρηνικά συστατικά και η έξοδος της στο κυτταρόπλασμα είναι ενεργητική και διαμεσολαβείται μερικώς από την exportin-1. Σε προηγούμενες μελέτες έχει δειχθεί ότι η διαλυτή τουμπουλίνη συνδεόμενη σε πυρηνικούς φακέλους με περιφερική ετεροχρωματίνη αναστέλλει τη σύνδεση της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης ΗΡ1. Ως εκ τούτου διερευνήσαμε με πειράματα συγκατακρίμνησης και ανοσοαποτύπωσης μετά από επίστρωση η αλληλεπίδραση της τουμπουλίνης με συστατικά του πυρηνικού φακέλου. Βρήκαμε ότι η τουμπουλίνη συνδέεται ειδικά με την ιστόνη Η3. και αναστέλλει τη σύνδεση της σε όλα τα είδη της ΗΡ1 και στον LBR. Επιπλέον, αποτρέπει το σχηματισμό του συμπλόκου ΗΡ1, LBR και core ιστονών και επομένως, θα μπορούσε να ρυθμίζει τη σύνδεση/αποσύνδεση της ΗΡ1 με τον πυρηνικό φάκελο. Το αντικαρκινικό φάρμακο πακλιταξέλη συνδέεται στην τουμπουλίνη και χρησιμοποιείται ευρέως στην θεραπεία ανθρωπίνων καρκινωμάτων. Ένα από τα μειονεκτήματα του φαρμάκου είναι η χαμηλή διαλυτότητα του στο νερό. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ανάλογα ταξόλης τα οποία περιέχουν πολλαπλά αντίγραφα ταξόλης συνδεδεμένα σε ένα συνθετικό φορέα Ac-[Lys-Aib-Cys(CH₂CO-2'-paclitaxel)]n-NH₂, n=2, 3, 4) και εμφανίζουν βελτιωμένη διαλυτότητα στο νερό. Η μελέτη με πειράματα ΜΤΤ της δράσης της ταξόλης και των παραγώγων της στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, έδειξε ότι το ανάλογο με τα 4 αντίγραφα ταξόλης αναστέλλει σε μεγαλύτερο βαθμό τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων συγκρινόμενο με τα άλλα συνθετικά παράγωγα και την ταξόλη. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής και ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η δράση του συγκεκριμένου αναλόγου στην ακινητοποίηση κυττάρων στην G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου καθώς και στην εμφάνιση πολυπύρηνων κυττάρων με ασυνέχεια στην πυρηνική περιφέρεια, είναι μεγαλύτερη από εκείνη της ταξόλης. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι το συνθετικό ανάλογο της ταξόλης εμφανίζει αυξημένη βιολογική δραστικότητα συγκρινόμενο με την ταξόλη.