Μελέτη των επιδράσεων εκπομπής κυματομορφών συχνοτήτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού της υδροχλωρικής δοξορουβικίνης και ενός συμπλόκου Ag(I) με οργανικούς υποκαταστάτες, σε in vivo μοντέλο λειομυοσαρκώματος

Abstract

The effects of electromagnetic waves on a biological system have guided the research toinvestigate the cancer response as a result of in vitro, in vivo and at a clinical level exposure to electromagnetic fields at low frequencies (EMF), resulting in very encouraging findingsregarding their antitumor activity. In this PhD thesis, we investigated the effects of emitted electromagnetic waveforms of frequencies, derived from the nuclear magnetic resonance spectrum (1Η-ΝΜR) of both doxorubicin hydrochloride, as well as, a complex of Ag(I) with tryphenylphosphine and 2- mercaptopyrimidine, in vitro and in vivo model of leiomyosarcoma. Specifically, we have conducted a comparative study of the effects of emitted EMF resonant frequencies of both compounds, with that of the compounds themselves, in various experimental procedures. Also, as internal control groups, we used the ham exposure and exposure to white noise. The evaluation of the cytotoxicity was conducted via MTT assay, whilst the percentage of the apoptosis-necrosis, as well as the cell cycle analysis (cell cycle arrest), were determined by flow cytometry analysis. Toxicological studies on healthy Wistar rats were conducted prior the anticancer studies. Haemotoxylin-eosin stain used for histopathological analysis. Tumor weight changes, survival days and histopatholocical profile, were used as indexes, in order to evaluate the anticancer properties in all groups of animals. The Ag(I) complex induces apoptosis on leiomyosarcoma (LMS) cells, in a dosedependent manner, and causes cell cycle arrest at S-phase, as also doxorubicin hydrochloride do, while the emitted EMF or white noise do not cause any cell death. The higher concentration of Ag(I) used in toxicological studies, caused cell death in most of the animals and histological lesions on lungs and liver. In contrast, the emission of EMF of resonant frequencies of the complex did not affect any of the organs. It has to be stated, that the 80% of the animals which were exposed to the electromagnetic waves of resonant frequencies of doxorubicin and 60% of the animals treated with the doxorubicin hydrochloride alone were totally cured and are still alive, with subsequent improvement of all anticancer indexes. A similar pattern of anticancer activity was followed by animals exposed to EMF resonant frequencies of silver complex (70%) or treated with the complex itself (50%). Also, the groups of animals exposed to EMF of both compounds manifested increased apoptotic phenomena on their tumors compared to those of animals treated with both compounds, while animals exposed to white noise or sham exposed animals did not present any difference at all in vivo procedures, compared to control group of animals. The emission of EMF resonant frequencies of both doxorubicin and silver complex induce higher anticancer activity in accordance to the increased survival levels, compared to that of animals treated with both compounds, probably due to the absence of side effects of the EMFs. Thus, it is necessary to investigate a possible mechanism of action, able to clarify the absence of side effects and simultaneously the high apoptotic levels on animal tumors, indicating strong anticancer effects.

Οι επιδράσεις των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων σε ένα βιολογικό σύστημα έχουν οδηγήσειτην έρευνα στην μελέτη της απόκρισης του καρκίνου, κατόπιν της in vitro, in vivo και κλινικού επιπέδου έκθεσής του, σε ηλεκτρομαγνητικά πεδία χαμηλών συχνοτήτων (EMF), με συνέπεια την εξαγωγή πολύ ενθαρρυντικών συμπερασμάτων όσον αφορά στην αντικαρκινική τους δράση. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκαν οι επιδράσεις εκπομπής ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων συχνοτήτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού της υδροχλωρικής δοξορουβικίνης και ενός συμπλόκου αργύρου Ag(I) με τριφαινυλοφωσφίνη και 2-μερκαπτοπυριμιδίνη, σε in vitro και in vivo μοντέλα λειομυοσαρκώματος. Οι συχνότητες συντονισμού προέρχονται από το 1Η-ΝΜR φάσμα των δύο χημικών μορίων. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη των επιδράσεων της εκπομπής των EMF συχνοτήτων συντονισμού και των δύο χημικών ενώσεων, με αυτές των ίδιων των χημικών ενώσεων, σε όλες τις ακόλουθες πειραματικές διαδικασίες. Επίσης για τον έλεγχο των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε εικονική έκθεση, και εκπομπή λευκού θορύβου. Η εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας έγινε μέσω της μεθόδου ΜΤΤ (MTT assay) ενώ η εκτίμηση των ποσοστών απόπτωσης-νέκρωσης καθώς και της αναστολής του κυτταρικού κύκλου, έγινε μέσω της κυτταρομετρίας ροής. Για την διασφάλιση των αντικαρκινικών μελετών, προηγήθηκαν οι μελέτες τοξικότητας σε υγιείς επίμυες, και η ιστοπαθολογική ανάλυση των οργάνων, με χρώσεις αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Ακολούθησαν οι αντικαρκινικές μελέτες, κατά τις οποίες εκτιμήθηκαν οι μεταβολές των όγκων των επιμύων, μέσω ειδικών δεικτών, οι ημέρες επιβίωσης, καθώς το ιστοπαθολογικό προφίλ. Το σύμπλοκο του Ag(I) επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, στα λειομυοσαρκωματικά (LMS) κύτταρα, κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο των LMS κυττάρων, στην S φάση, όπως και η υδροχλωρική δοξορουβικίνη ενώ η εκπομπή των EMF δεν επιφέρει κυτταρικό θάνατο, όπως επίσης και η εκπομπή λευκού θορύβου. Η υψηλότερη δόση του συμπλόκου Ag(I) προκάλεσε το θάνατο στο μεγαλύτερο ποσοστό των επιμύων, και επέφερε ιστολογικές αλλοιώσεις, στον πνεύμονα και στο ήπαρ, αλλά δεν επηρέασε τα υπόλοιπα όργανα, εν αντιθέσει με την εκπομπή των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων, που δεν επηρέασαν κανένα σύστημα. Η εκπομπή των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων συχνοτήτων συντονισμού της δοξορουβικίνης, επέφερε πλήρη ίαση στο 80% των πειραματοζώων ενώ η δοξορουβικίνη στο 60%, με ταυτόχρονη πτώση των δεικτών μεταβολής των όγκων. Επίσης η εκπομπή τωνηλεκτρομαγνητικών κυμάτων συχνοτήτων συντονισμού του συμπλόκου Ag(I), επέφερε ίασηστο 70% των ζώων, ενώ το σύμπλοκο Ag(I), στο 50%. Η ιστοπαθολογική εικόνα παρουσίασεαυξημένη απόπτωση στους όγκους που υποβλήθηκαν στα EMF, σε σχέση με τα θεραπευτικά σχήματα χορήγησης της δοξορουβικίνης και του συμπλόκου του Ag(I). Οι ομάδες των πειραματοζώων της εικονικής έκθεσης στα ηλεκτρομαγνητικά κύματα και της εκπομπής λευκού θορύβου δεν παρουσίασαν καμία διαφορά σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες. Η εκπομπή ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων συχνοτήτων συντονισμού της δοξορουβικίνης και του συμπλόκου Ag(I), επιφέρει καλύτερη in vivo αντικαρκινική δράση σε συνδυασμό με τα υψηλά ποσοστά επιβίωσης, σε σχέση με τις δύο κυτταροτοξικές ουσίες, ίσως λόγω της απουσίας τοξικολογικών επιδράσεων από την εκπομπή των EMF. Επίσης είναι αναγκαίο να διερευνηθεί ο μηχανισμός δράσης, ο οποίος να εξηγεί μεν, την έλλειψη κυτταροτοξικής δράσης των EMF in vitro, αλλά και την ισχυρή αποπτωτική τους επίδραση in vivo.