Διερεύνηση της μονοκλωνικότητας των λεμφοκυττάρων των σιαλογόνων αδένων στο σύνδρομο sjogren και της πιθανής συσχέτισης με το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού

Abstract

Sjogren’s Syndrome (SS) is a chronic autoimmune disorder characterized by lymphocytic infiltration of the exocrine glands associated with polyclonal B-cell hyperactivity and 44 times greater risk compared to the normal population for developing malignant lymphoma, especially low-grade extranodal marginal zone B-cell lymphoma of MALT type. MALT accumulates secondarily mainly in the major salivary glands in the form of LymphoEpithelial Sialadenitis in response to the autoimmune process and B-cell monoclonality is considered an early event with unknown malignant potential in the long course of lymphomagenesis. On the other hand, Helicobacter pylori (Hp)-associated gastritis predisposes to MALT acquisition, antigastric autoantibody production and eventually gastric MALT lymphoma development, while almost 5% of the non-responsive to bacterial eradication cases are cytogenetically associated with the mutant form of the pro-apoptotic protein BCL10. SS is a multifactorial disease with most probably an infectious triggering stimulus, but until now no single viral or microbial agent has been identified. Although Helicobacter pylori is a common resident of oral microbial plaque and saliva, seroprevalence studies in SS patients have shown conflicting results and the bacterium has only rarely been investigated in salivary gland lymphoid tissues. The aim of this study was to evaluate the development of acquired MALT and B-cell monoclonal expansion in the labial salivary glands of patients with Sjogren’s syndrome and to assess their possible association with Helicobacter pylori presence and BCL-10 expression. The material of the present study derived from the files of the Department of Oral Pathology and Oral Medicine, Faculty of Dentistry, National and Kapodistrian University of Athens, Greece. Data processing for salivary gland tissue biopsies with a histopathological diagnosis of Sjogren’s Syndrome during the period 1974-2004 retrieved 90 cases among a total of 22,403 biopsies (0.4%). Of these, 7 cases originated from the parotid and 83 from the labial salivary glands. Preliminary evaluation based on the biopsy request forms, regarding the fulfillment of exclusion criteria for SS diagnosis, fixation time of 24-48 hours and absence of an inflammatory overlying mucosa at the biopsy site, as well as histological examination on hematoxylin and eosin sections for tissue adequacy and a focus score ? 1, came up with 40 cases. Sjogren’s Syndrome diagnosis according to the recently revised classification criteria was verified in all cases after contact with the attendant clinician. Thirty eight (38) cases referred to females, with age ranging between 29 and 78, (mean age 56 years). Subsequent classification of the lymphoplasmacytic infiltrates according to Tarpley’s grading system revealed 14 cases with grade I, 12 cases with grade II, 11 319 cases with grade III and 3 cases with grade IV. Twenty cases of chronic non-specific sialadenitis of the labial salivary glands, unrelated to SS, served as controls. A routine, indirect, three-step labelled streptavidin-biotine-peroxidase method (LSAB-Labelled Streptavidin Βiotin) with the use of UltraVision Detection System (Anti-Polyvalent, HRP/DAB, Specificity:Anti-Mouse IgG (H+L), Anti-Rabbit IgG (H+L) -Lab Vision Corporation-Neomarkers, 47790 Westinghouse Drive Fremont CA 94539 USA, Cat.# TP-015-HD) was applied on 4-μm deparaffinized serial tissue sections. Immunostaining was performed using the primary antibodies against CD3 (mouse monoclonal anti-human, Clone/Ref: F7.2.38, Class/Subclass: IgG1, Kappa, Dako Corporation, Carpinteria, CA93013 USA, Code No.: NP0501/200, optimal dilution 1:200, at Room Temperature (RT) for 30 min), CD20 (mouse monoclonal anti-human, Clone/Ref: L26, Class/Subclass: IgG2a, Kappa, Dako Corporation, Carpinteria, CA93013 USA, Code No.:NP004, optimal dilution: 1:400, at RT for 30 min), kappa (rabbit polyclonal, Lab Vision-Neomarkers, 47790 Westinghouse Drive Fremont CA 94539 USA, Cat. #RB-333, optimal dilution 1:800, at RT for 30 min) and lambda light chains (rabbit polyclonal, Lab Vision- Neomarkers, 47790 Westinghouse Drive Fremont CA 94539 USA, Cat. #RB-334, optimal dilution 1:400, at RT for 30 min), Helicobacter pylori (rabbit polyclonal, Lab Vision- Neomarkers, Westinghouse Drive Fremont CA 94539 USA, Cat. # RB-1875, optimal dilution 1:700, at RT for 30 min) and BCL10 (mouse monoclonal anti-human, Clone/Ref: 331.3, Class/Subclass: IgG1, Santa-Cruz Biotechnology, Inc. USA, Cat. # sc-5273, optimal dilution 1:60, at RT for 30 min). Giemsa stain was also applied for comparative assessment of anti-H.pylori’s immunoreaction. Antigen retrieval was performed for all antibodies with placement of the sections in plastic slide racks containing citrate buffer 10X and heating in a 750 W microwave oven for 2 circles of 4 minutes. Diamino-benzidine (DAB Chromogen, Ultra Vision Detection System, Lab Vision-Neomarkers, Cat.# TA-002-HDC) was used as chromogen and all slights were counterstained with Mayer’s hematoxylin (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA) and coded to ensure blind analysis by the two observers (E.P. and E.Ch.). Salivary gland tissues were assessed for the presence of ectopic lymphoid neo-organogenesis, acquired MALT formation and clonal B-cell expansion in association with Helicobacter pylori detection and BCL-10 expression. In addition, the following immunohistomorphological features were estimated: growth pattern of lymphoid infiltrates, number of lymphoid follicles and associated germinal centers, number and type of lymphoepithelial lesions, number and distribution of centrocyte-like cells of the marginal zone, number and distribution of plasma cells and presence of Dutcher bodies. A semiquantitative analysis for light chain restriction was employed and all specimens were reclassified into one of the following diagnostic categories: Focal Lymphocytic Sialadenitis, LymphoEpithelial Sialadenitis with fully benign lymphoid infiltrate, LymphoEpithelial Sialadenitis with «lymphoproliferative lesions» and Extranodal marginal zone B-cell lymphoma of MALT type

To σύνδρομο Sjogren (Sjogren’s Syndrome-SS) αποτελεί μία χρόνια αυτοάνοση διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από λεμφοκυτταρική διήθηση των εξωκρινών αδένων και αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης κακοήθους λεμφώματος, κυρίως εξωλεμφαδενικό, Β-λέμφωμα της οριακής ζώνης, τύπου MALT. Ο επίκτητος Λεμφικός Ιστός των Βλεννογόνων (Mucosa Associated Lymphoid Tissue-MALT) αναπτύσσεται κυρίως στους μείζονες σιαλογόνους αδένες με τη μορφή της ΛεμφοΕπιθηλιακής Σιαλαδενίτιδας ως απάντηση στην αυτοάνοση εξωκρινοπάθεια, κατ’ αναλογία με τη χρόνια γαστρίτιδα σε έδαφος λοίμωξης από το Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, η οποία προδιαθέτει στην πρόσκτηση επίκτητου MALT και τελικά στην ανάπτυξη γαστρικού λεμφώματος MALT, 5% των οποίων σχετίζονται με μεταλλάξεις στο γονίδιο της πρωτείνης BCL-10. Μολονότι όμως το Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού ανευρίσκεται συχνά στο σίαλο και την οδοντική μικροβιακή πλάκα, η παρουσία του στους ελάσσονες σιαλογόνους αδένες των ασθενών με SS δεν έχει μελετηθεί. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της μονοκλωνικότητας των Β-λεμφοκυττάρων σε ελάσσονες σιαλογόνους αδένες ασθενών με πρωτοπαθές SS και η συσχέτισή της με την ανάπτυξη επίκτητου MALT, την έκφραση της πρωτείνης BCL-10 και την παρουσία του Ελικοβακτηριδίου. To υλικό της μελέτης προερχόταν από το Αρχείο του Εργαστηρίου της Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής Αθηνών και αποτελούνταν από 40 ιστοτεμάχια ελασσόνων σιαλογόνων αδένων κάτω χείλους ασθενών με πρωτοπαθές SS, εκ των οποίων 14 ήταν βαθμού Ι, 12 βαθμού ΙΙ, 11 βαθμού ΙΙΙ και 3 βαθμού IV κατά Tarpley. Για τη συγκριτική αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκαν 20 ιστοτεμάχια με χρόνια, μη ειδική σιαλαδενίτιδα. Εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος της σημασμένης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης ϋπεροξειδάσης σε 3 στάδια με τη χρήση των αντισωμάτων anti-CD3 (Dako, USA), anti-CD20 (Dako, USA), anti-kappa και anti-lambda (Neomarkers, USA), anti-Helicobacter pylori (Neomarkers, USA) και anti-BCL10 (Santa Cruz, USA) καθώς και η ιστοχημική χρώση Giemsa. Όλες οι περιπτώσεις με βαθμό κατά Tarpley ? ΙΙ (26/40, 65%) εμφάνιζαν ανάπτυξη επίκτητου ΜΑLT με τη μορφή της ΛεμφοΕπιθηλιακής Σιαλαδενίτιδας (p< 0,05) και κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτείνης BCL-10 στα κύτταρα των βλαστικών κέντρων (p <0,05). 9/26 περιπτώσεις (34,6%) εμφάνιζαν εστιακά περιορισμό των ελαφρών αλύσων σε συσχέτιση με περιοχές λεμφοϋπερπλασίας (p<0,05), ενώ η παρουσία της Β-μονοκλωνικότητας συσχετίζονταν προγνωστικά με τον αριθμό των βλαστικών κέντρων/ιστοτεμάχιο. Σε 7/26 (7/26, 27%) περιπτώσεις παρατηρούνταν καμπυλοειδείς μορφές του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού εντός τελικών εκφορητικών πόρων (p< 0,05), εκ των οποίων 3 (3/7, 43%) εμφάνιζαν περιορισμό των ελαφρών αλύσεων. Σε καμμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη επίκτητου MALT, Β-μονοκλωνικότητα, έκφραση της πρωτείνης BCL-10 ή παρουσία του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού στην ομάδα ελέγχου. Συμπερασματικά, η ανάπτυξη επίκτητου ΜΑLT και η μονοκλωνική έκπτυξη των Β-λεμφοκυττάρων στους ελάσσονες σιαλογόνους αδένες των ασθενών με SS μπορεί να συσχετίζεται αιτιοπαθογενετικά σε κάποιες περιπτώσεις με την παρουσία του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού και την επίμονη BCL-διαμεσολαβούμενη αντιγονική διέγερση του υποδοχέα BCR των αυτοδραστικών Β-λεμφοκυττάρων. Πρόσθετες μελέτες απαιτούνται για την πλήρη αποσαφήνιση του ρόλου του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού και της πρωτείνης BCL-10 στην παθοβιολογία του συνδρόμου Sjogren