Κλωνοποίηση, έκφραση γονιδίων δύο νέων απακετυλασών χιτοολιγοσακχαριτών: απομόνωση, βιοχημικός χαρακτηρισμός

Abstract

The genomes of Bacillus cereus and its closest relative Bacillus anthracis contain two LmbE protein family homologues. Only a few members of this family have been presently biochemically characterized including N-acetylglucosaminylphosphatidyl inositol, 1-D-myo-inosityl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucopynanoside, diacetylchitobiose, and lipoglycopeptide antibiotic de-N-acetylases. All these enzymes share a common feature to de-N-acetylate the N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) moiety of their substrates. The genes bc1534 and bc3461 from B. cereus ATCC14579 have been cloned and expressed in E. coli and the recombinant enzymes have been purified to homogeneity and further characterized. The enzymes exhibited different molecular masses, pH and temperature optima and a broad substrate specificity, de-N-acetylating GlcNAc, N-acetylchitooligomers (GlcNAc2-4) as well as GlcNAc-1P, GlcNAc-6P, GalNAc, ManNAc, UDP-GlcNAc. However the enzymes were not active on radiolabeled glycol chitin, N-acetyl-D-glucosaminyl-(β-1,4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (GMDP), N-acetyl-D-GlcN-α1-6-D-myo-inositol-1-HPO4-octadecyl (GlcNAc-I-P-C18). Kinetic analysis of BC1534, and BC3461 towards GlcNAc1-2 and docking experiments with selected substrates confirmed GlcNAc2 as the favoured one for both native enzymes. Based on the recently determined crystal structure of BC1534, a mutagenesis analysis was carried out focusing on key residues. The catalytic efficiency of BC1534 variants was significantly decreased compared to the native enzyme. An alignment-based tree places both de-N-acetylases to different functional categories from other LmbE proteins.

Τα γονιδιώματα τόσο του Bacillus cereus όσο και του συγγενικού του οργανισμού Bacillus anthracis περιέχουν δύο μέλη της πρωτεϊνικής οικογένειας LmbE, ομόλογα μεταξύ τους. Τα μέχρι σήμερα χαρακτηρισμένα μέλη της οικογένειας αυτής είναι ένζυμα με ενεργότητα απακετυλάσης της Ν-ακετυλ γλυκοσαμίνης (GlcNAc) της Ν-ακετυλγλυκοσαμινυλφωσφατιδυλ ινοσιτόλης, του 1-D-μυο-ινοσιτυλ-2-ακεταμιδο-2-δεοξυ-α-D-γλυκοπυρανοσιδίου, της Ν,Ν’-διακετυλχιτοβιόζης και λιπογλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών. Τα γονίδια bc1534 και bc3461 από τον B. cereus ATCC14579 κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε E. coli. Τα ανασυνδυασμένα ένζυμα απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά. Εμφανίζουν διαφορές στα μοριακά βάρη, καθώς και στις βέλτιστες συνθήκες pH και θερμοκρασίας, ενώ όπως και τα άλλα μέλη της οικογένειας είναι απακετυλάσες GlcNAc μεγάλου εύρους υποστρωμάτων, όπως του μονομερούς GlcNAc, Ν-ακετυλχιτοολιγομερή (GlcNAc2-4) καθώς και τροποποιημένα υποστρώματα όπως GlcNAc-1P, GlcNAc-6P, GalNAc, ManNAc, UDP-GlcNAc. Αντίθετα και τα δύο ένζυμα δεν είναι ενεργά σε ραδιενεργά σημασμένη γλυκολ-χιτίνη, σε Ν-ακετυλ-D-γλυκοσαμινυλ-(β-1,4)-Ν-ακετυλμουραμυλ-L-αλανυλ-D-ισογλουταμίνη (GMDP) και σε Ν-ακετυλ-D-Ν-γλυκοσαμινυλ-α1-6-D-μυο-ινοσιτολ-1-HPO4-οκταδεκυλ (GlcNAc-I-P-C18). Κινητική ανάλυση των πρωτεϊνών BC1534, BC3461 προς τα υποστρώματα GlcNAc1-2 σε συνδυασμό με πειράματα ελλιμενισμού με επιλεγμένα υποστρώματα, ταυτοποίησαν το GlcNAc2 ως το προτιμώμενο υπόστρωμα και για τα δύο ένζυμα αγρίου τύπου. Βασισμένοι στην τρισδιάστατη δομή της BC1534, πραγματοποιήθηκε σειρά πειραμάτων εισαγωγής σχεδιασμένων μεταλλαγών, εστιάζοντας σε κατάλοιπα-κλειδιά. Η αποτελεσματικότητα κατάλυσης των μεταλλαγμάτων ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με το ένζυμο αγρίου τύπου. Τέλος, ένα δέντρο βασισμένο στην στοίχιση μεταξύ πρωτεϊνών της LmbE οικογένειας, κατατάσσει τις BC1534 και BC3461 σε διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες από άλλα μέλη.