Πολυδιάστατες τεχνικές διαχωρισμού και δυναμικές τεχνικές φασματοσκοπίας μάζας για την ανίχνευση πρωτεϊνικών βιοδεικτών

Abstract

This thesis was focused on method development for the characterization of the urinary proteome with the detection of bladder cancer protein biomarkers as its upper goal. In order to fulfill this scope, two separate approaches were utilized. The development of multidimensional separation schemes combined with MS and Tandem MS, as well as the development of an MS profiling methodology for the direct classification of urine against the health vs. bladder cancer question. More specifically, for the characterization of the urine proteome, two dimensional electrophoresis was utilized at first. The resolved proteins were identified with MS. To further enrich this approach preparative electrophoresis was added to the scheme as a prefractionation technique. Following that, urine was analyzed in a different manner with the use of acrylamide electrophoresis and the analysis of the gel bands via liquid chromatography tandem mass spectrometry. This method was also enriched by the insertion of two different prefractionation steps such as preparative electrophoresis and protein liquid chromatography. Urine protein profiling was developed and evaluated with the use of a reference sample. This sample was prepared by using different methods and each of those was evaluated by the quality of the generated MS profile. The optimum scheme was then used for the analysis of about 180 clinical urine samples from patients suffering from different grades of bladder cancer malignancy and healthy persons. The results were used for model generation via customized and commercially available software tools. The profiling models were evaluated thoroughly for their predictive ability in health vs. cancer assessment.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη μεθόδων για τον πρωτεωμικό χαρακτηρισμό ούρων με απώτερο στόχο την ανίχνευση πρωτεϊνικών βιοδεικτών για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. Για την επίτευξη αυτού του στόχου χρησιμοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις. Η ανάπτυξη μεθοδολογιών πολυδιάστατων τεχνικών διαχωρισμού ηλεκτροφόρησης και υγροχρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών για την διερεύνηση του πρωτεώματος των ούρων και, παράλληλα, η ανάπτυξη μεθόδου καταγραφής προφίλ μάζας ιόντων για τον απευθείας χαρακτηρισμό των ούρων με φασματομετρία μάζας στο ερώτημα υγεία έναντι νεοπλασίας. Αναλυτικότερα, η ενδελεχής προσέγγιση περιελάμβανε σε αρχικό στάδιο τη χρήση δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης και ταυτοποίηση των διαχωριζόμενων πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας. Η μέθοδος εμπλουτίστηκε με τη χρήση παρασκευαστικής ηλεκτροφόρησης. Στη συνέχεια, επιχειρήθηκε ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών των ούρων με ηλεκτροφόρηση μιας διάστασης και ανάλυση του πηκτώματος με υγρή χρωματογραφία διαδοχική φασματομετρία μάζας. Και αυτή η μέθοδος εμπλουτίστηκε με δύο τεχνικές κλασματοποίησης, παρασκευαστική ηλεκτροφόρηση και πρωτεϊνική υγρή χρωματογραφία, αντίστοιχα. Η μέθοδος προφιλομετρίας μάζας αναπτύχθηκε σε δείγμα ούρων αναφοράς με τη διερεύνηση διαφορετικών διαδικασιών προετοιμασίας δείγματος και μέτρηση του παραγομένου προφίλ μάζας με φασματομετρία μάζας. Η βέλτιστη διαδικασία εφαρμόστηκε σε 180 περίπου κλινικά δείγματα ούρων από ασθενείς με νεοπλασία της ουροδόχου κύστης και χωρίς. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με προσαρμοσμένα και εμπορικά διαθέσιμα λογισμικά με σκοπό την ανάπτυξη ενός μοντέλου με τη βοήθεια του οποίου θα καθίσταται δυνατή n πρόβλεψη ύπαρξης ή μη ύπαρξης παθολογίας ως προς τη συγκεκριμένη νεοπλασία από το συλλεγόμενο προφίλ μάζας.