Βιοαποικοδόμηση αμυλούχων υλικών για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας ή/και οργανικών διαλυτών

Abstract

Xanthan gum is an extracellular heteropoly-saccharide, which is produced by the aerobic fermentation of Xanthomonas campestris. Xanthan is composed of pentasaccharide repeating units, containing D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid (at a ratio 2:2:1). The polymer backbone consists of 1,4 linked β-D-glucose and is identical in structure to cellulose. Trisaccharide side chains alternating anhydroglucose units distinguish xanthan gum form cellulose. Each side chain comprises a glucuronic acid residue between two mannose units. At most of the terminal mannose units there is a pyruvate moiety and the mannose nearest the main chain carries a single acetyl group at C-6. Xanthan gum’s major value is its capacity to impart useful rheological properties to aqueous systems. Due to its excellent rheological properties, xanthan has various applications, mainly in food industry as thickening, suspending and stabilizing agent. It has also wide applications in the chemical industry (personal care applications, enhanced oil recovery etc). In this thesis, we studied the production of xanthan gum by Xanthomonas campestris w.t. from various starchy substrates including chestnut flour and some of its components (for the first time), starch, cornstarch, oat (bulk and flour), rice (flour) and potato (flour). Fermentations were carried out in flasks and in 2L bioreactor. Our results showed that xanthan gum could be produced from these substrates with the remarkable production from chestnut and its insoluble sugars. Afterwards, we studied the effects of agitation levels on fermentation kinetics in batch cultures (from synthetic substrate, in 2L bioreactor) and also on the chemical composition -in terms of pyruvate content- and molecular weight of the product formed. Increased agitation levels resulted in higher production rates and biomass levels, while product formation appeared to be partly growth associated. The chemical structure of xanthan was influenced by agitation, as the pyruvate content increased with increasing stirrer speeds. However, no significant effect was observed on xanthan molecular weight as the stirrer speed increased. Finally, we studied the cultural conditions for xanthan gum production by Xanthomonas campestris w.t., to maximize the cell production and the yield of the polysaccharide (from synthetic substrate and whey, in 2L bioreactor) using response surface methodology. We studied also the production of xanthan gum and the cell production from tobacco extracts (for the first time). In all of these cases, a second order polynomial model was fitted and optimum conditions for the production of xanthan gum and biomass were estimated. The chemical composition -in terms of pyruvate content- and molecular weight of the product formed was also studied.

Η ξανθάνη (ή κόμεο ξανθάνης) είναι ένας ανιονικός εξωκυττάριος, υψηλού μοριακού βάρους πολυσακχαρίτης, και παράγεται από τον μικροοργανισμό Xanthomonas campestris με αερόβια ζύμωση. Αποτελείται από τρεις διαφορετικούς μονοσακχαρίτες, D-γλυκόζη, D-μαννόζη, και D-γλυκουρονικό οξύ σε αναλογία 2:2:1 με τη γραμμική κύρια αλυσίδα του πολυμερούς να συντίθεται αποκλειστικά από μόρια β-D-γλυκόζης ενωμένα με (1,4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Σε κάθε δεύτερη γλυκόζη και στη θέση C-3, υπάρχει ενωμένη πλευρική αλυσίδα (τρισακχαρίτης) που αποτελείται (διαβάζοντας από το τέλος προς την αρχή) από β-D-μαννόζη-(1,4)-β-D-γλυκουρονικό οξύ-(1,2)-α-D-μαννόζη. Ανάλογα με τις συνθήκες ζύμωσης, το τελικό τμήμα της μαννόζης μπορεί να έχει ενωμένο πυροσταφυλικό οξύ σε θέσεις 4- και 6-, ενώ και η μαννόζη στο εσωτερικό της ξανθάνης μπορεί είναι ακετυλιωμένη στη θέση -6. Τέλος, στην πλευρική της αλυσίδα μπορεί να είναι συνδεδεμένα άλατα, συνήθως καλίου, νατρίου και ασβεστίου. Εξαιτίας των σημαντικών φυσικοχημικών της ιδιοτήτων και της αξιόλογης ψευδοπλαστικής συμπεριφοράς που προσδίδει στα διαλύματα της, αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς πολυσακχαρίτες που χρησιμοποιούνται σήμερα στη βιομηχανία. Βρίσκει εφαρμογή κατά κύριο λόγο στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων, αλλά χρησιμοποιείται και σε άλλους τομείς της βιομηχανίας, ακόμα και στη διαδικασία εξόρυξης πετρελαίου. Το ευρύτατο αυτό πεδίο εφαρμογής της δικαιολογεί και το αμείωτο ενδιαφέρον των ερευνητών για την όσο το δυνατόν καλύτερη κατανόηση της διεργασίας παραγωγής της. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε αρχικά η καλλιέργεια του άγριου (μη τροποποιημένου) στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση υποστρωμάτων από αμυλούχα υλικά διαφορετικής προέλευσης. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δυνατότητα χρήσης του καστανάλευρου ως υποστρώματος, για πρώτη φορά, (ενώ έγιναν και ξεχωριστές μελέτες απομονωμένων συστατικών του) και του αμύλου [τα πειράματα διεξήχθησαν σε κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα]. Επίσης, μελετήθηκε κι η δυνατότητα χρήσης του καλαμποκάλευρου, της βρώμης (τόσο σε ακατέργαστη μορφή όσο και ως άλευρο), του ρυζιού (άλευρο) και της πατάτας (άλευρο) [τα πειράματα διεξήχθησαν σε κωνικές]. Από τα παραπάνω πειράματα προέκυψε ότι η παραγωγή της ξανθάνης με τη χρήση υποστρώματος από καστανάλευρο παρουσίασε το μεγαλύτερο ενδιαφέρον σε σχέση με τα υπόλοιπα αμυλούχα υλικά. Επίσης σημαντική παραγωγή παρατηρήθηκε και με τη χρήση των διαλυτών σακχάρων (από το καστανάλευρο) ως υπόστρωμα. Ακολούθως, μελετήθηκε η καλλιέργεια του άγριου στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση συνθετικού υποστρώματος (σε βιοαντιδραστήρα), για διάφορους ρυθμούς ανάδευσης. Από τα πειράματα αυτά προέκυψε ότι η αύξηση του ρυθμού ανάδευσης της καλλιέργειας συμβάλει θετικά στην παραγωγή της ξανθάνης, η οποία εμφανίζεται να είναι μερικώς συσχετιζόμενη με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Επίσης, επηρεάζει θετικά και τις κινητικές παραμέτρους που περιγράφουν τη διεργασία της ζύμωσης, όπως ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων, καθώς και ο ρυθμός παραγωγής του πολυσακχαρίτη. Η περιεκτικότητα της παραγόμενης ξανθάνης σε πυροσταφυλικό οξύ αυξάνει με την αύξηση του ρυθμού ανάδευσης, σε αντίθεση με το μοριακό της βάρος, το οποίο ήταν σταθερό σε όλες τις περιπτώσεις. Τέλος, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης για την καλλιέργεια του άγριου στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση συνθετικού υποστρώματος και υποστρώματος από τυρόγαλα (σε βιοαντιδραστήρα), καθώς και με τη χρήση υποστρώματος (για πρώτη φορά) από παραπροϊόντα της επεξεργασίας καπνού. Από τα παραπάνω προέκυψαν μαθηματικά μοντέλα που περιγράφουν την παραγωγή ξανθάνης και βιομάζας ως συνάρτηση βασικών για τη διεργασία παραμέτρων και επιπλέον μελετήθηκαν ορισμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της παραγόμενης ξανθάνης, όπως το μοριακό της βάρος και η περιεκτικότητα της σε πυροσταφυλικό οξύ, η οποία φαίνεται να επηρεάζεται από τις πειραματικές συνθήκες που διερευνήθηκαν.