Αναλυτικές, κινητικές μέθοδοι και δομικές μελέτες για την διερεύνηση εξειδικευμένων βιοτεχνολογικών εφαρμογών πρωτεολυτικών ενζύμων σε ελεύθερη και ακινητοποιημένη μορφή

Abstract

Proteases found a wide application in various areas, such as biotechnology, food production, animal feed, pharmaceuticals and cosmetics, etc., being important research tools for development. Thus, the elucidation of their mechanism of action and its correlation with their structure, i.e. the ways of interacting with their ligand molecules (substrates, inhibitors, etc.), apart from a research interest, are prerequisites in using these enzymes in specific biotechnological and other applications. In this dissertation analytical, kinetic and structural/computational methodologies were employed targeting on the investigation of specialized biotechnological applications of two proteases, the porcine pancreatic elastase (PPE), and the rennin from Rhizomucor pusillus (MPR).The mechanism of reversible inhibition of PPE was investigated for first time using Trifluor-acetyl-dipeptidyl-p-trifluor-anilides, where in addition to the potential design of remedy derivatives counter to the pathogenesis of emphysema, they have decisively contributed to the investigation of enzyme-substrate interactions and the design and synthesis of important substrates of other proteases useful in biotechnological applications. The hydrolysis of substrate Suc-AAA-pNA by the PPE has been thoroughly analyzed using kinetic methodologies in presence and absence of reversible inhibitors of the general type CF3C(O)-ΧA-NHPh-p-CF3 (where Χ={K,V,D}), and additionally computer simulations were performed to study the PPE/reversible inhibitors’ interactions.The results showed that although the hydrolysis of Suc-ΑΑΑ-pΝΑ by PPE in the absence of reversible inhibitors proceeds via a virtual transition state comprising a minor physical step and a major chemical step, where two stabilized reactant states precede the dominant acyl-enzyme, however the same hydrolytic reaction, in presence of the reversible inhibitors, proceeds without the formation of a virtual transition state, thus showing a different type of catalysis, which is performed through a structurally modified PPE-molecule. Finally, a novel detailed mechanism of the reversible inhibition of PPE is suggested.MPR is a well promising substitute of bovine chymosin, with a worldwide increasing use. Therefore, the development of an automatic and sensitive method of quantitative determination of the MPR activity, in free as well as in immobilized form, along with the elucidation of its mechanism of action are a challenge for a widespread use of MPR in industrial cheese production. The absence of a analytically robust substrate, to be used for the quantitative determination of the MPR activity was a problem. The already existing substrates did provide neither reliable quantitative determinations of the MPR activity, nor the possibility of investigating its mechanism of action, due to errors of indirect, non-automated measurements that allowed.Consequently, the design of fluorimetric peptide substrates was chosen, where during their hydrolysis a Fluorescence Resonance Energy Transfer occurs due to a Förster resonance (FRET-peptides). By employing computational simulation techniques, the binding interactions of a series of potential FRET-substrates onto the active site of MPR were determined, and the stability of the formed MPR/FRET-peptide complexes was examined. In this way, they were chosen these substrates with the requisite characteristics; it was followed the stepwise synthesis of the FRET-substrates in liquid phase (Fmoc/Butyl) by means of the mixed anhydride method.By based on the fluorescence emission spectra (max. λem = 415 nm) recorded during the hydrolysis reactions of four synthesized FRET-substrates by MPR, it was shown that only three of them, the Abz-GFY-pNA, Abz-SFY-pNA and Abz-GFI-pNA should be further considered. The kinetic studies, by the use of the abovementioned FRET-substrates showed that the Abz-GFY-pNA possesses the required characteristics, i.e. high specificity and sensitivity. Therefore, a novel automated and statistically robust method has been developed for the quantitative determination of the MPR activity, in free as well as in immobilized form, by based on the fluorescence intensity variation (λem = 415 nm, λex = 340 nm) during the hydrolysis of Abz-GFY-pNA; likewise, a new mechanism of action was proposed, which highlights some key-features of the catalytic action of MPR, which could be also assigned to other aspartic proteases.

Οι πρωτεάσες έχουν ευρεία εφαρμογή σε διάφορους τομείς, όπως η βιοτεχνολογία, η παραγωγή τροφίμων, οι ζωωτροφές, τα φάρμακα και τα καλλυντικά κ.α., αποτελώντας σημαντικά εργαλεία έρευνας με σκοπό την ανάπτυξη. Έτσι, η αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης τους και η συσχέτισή της με την δομή τους, δηλαδή οι τρόποι αλληλεπίδρασης τους με τα μόρια των υποκαταστατών τους (υποστρώματα, αναστολείς, κ.λ.π.), εκτός από το ερευνητικό τους ενδιαφέρον, είναι προαπαιτούμενα για την χρήση των ενζύμων αυτών σε εξειδικευμένες βιοτεχνολογικές και άλλες εφαρμογές. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν αναλυτικές, κινητικές και δομικές/υπολογιστικές μεθοδολογίες για την διερεύνηση εξειδικευμένων βιοτεχνολογικών εφαρμογών δύο πρωτεολυτικών ενζύμων, της παγκρεατικής ελαστάσης χοίρου (PPE) και της ρεννίνης από τον μικροοργανισμό Rhizomucor pusillus (MPR).Διερευνήθηκε για πρώτη φορά ο μηχανισμός της αντιστρεπτής αναστολής της PPE από Τριφθορο-ακετυλ-διπεπτιδικά-π-τριφθορο-ανιλίδια, που εκτός τον πιθανό μελλοντικό σχεδιασμό παραγώγων κατά της παθογένεσης του εμφυσήματος, συνέτεινε αποφασιστικά στην διερεύνηση αλληλεπιδράσεων τύπου ενζύμου-υποστρώματος και από αυτές στον σχεδιασμό και την σύνθεση σημαντικών υποστρωμάτων άλλων πρωτεασών, χρήσιμων σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Αναλύθηκε διεξοδικά, με εφαρμογή κινητικών μεθοδολογιών, η υδρόλυση του υποστρώματος Suc-AAA-pNA από την PPE παρουσία και απουσία αντιστρεπτών ενζυμικών αναστολέων του τύπου CF3C(O)-ΧA-NHPh-p-CF3 (όπου Χ={K,V,D}) και πραγματοποιήθηκαν, επίσης, υπολογιστικές προσομοιώσεις για μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ PPE και των αντιστρεπτών αυτών αναστολέων.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ η υδρόλυση του Suc-ΑΑΑ-pΝΑ από την ΡΡΕ, απουσία αντιστρεπτών αναστολέων, προχωρά μέσω μίας εικονικής μεταβατικής κατάστασης που περιλαμβάνει ένα ελάσσον φυσικό κι ένα κυρίαρχο χημικό στάδιο με δύο σταθεροποιημένες καταστάσεις αντιδρώντων να προηγούνται του κυρίαρχου ακυλο-ενζύμου, ωστόσο η ίδια υδρολυτική αντίδραση, παρουσία των αντιστρεπτών αναστολέων, αποδείχθηκε ότι προχωρά με απουσία εικονικής μεταβατικής κατάστασης, υποδεικνύοντας έτσι έναν διαφορετικό τρόπο κατάλυσης, η οποία πραγματοποιείται μέσω ενός τροποποιημένου δομικά ενζυμικού μορίου. Ως τελικό συμπέρασμα προτείνεται ένας νέος και λεπτομερής μηχανισμός αντιστρεπτής αναστολής της PPE.Η MPR είναι ένα πολλά υποσχόμενο υποκατάστατο της βοοειδούς χυμοσίνης, με αυξανόμενη χρήση, παγκοσμίως. Έτσι, η ανάπτυξη μιας αυτοματοποιημένης και ευαίσθητης μεθόδου προσδιορισμού δραστικότητας της MPR, σε ελεύθερη και ακινητοποιημενη μορφή και η αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης της αποτελούν πρόκληση για την ευρεία χρήση της στην βιομηχανική παραγωγή τυριού. Η απουσία ευαίσθητου και αναλυτικά αξιόπιστου υποστρώματος για ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικότητας της MPR αποτελούσε πρόβλημα. Τα υπάρχοντα υποστρώματα δεν προσέφεραν αξιόπιστους ποσοτικούς προσδιορισμούς της δραστικότητας της MPR, ούτε δυνατότητα διερεύνησης του μηχανισμού δράσης της, λόγω σφαλμάτων των εμμέσων, μη αυτοματοποιημένων μετρήσεων, που αυτά επέτρεπαν.Έτσι επιλέχθηκε ο σχεδιασμός φθορισμομετρικών πεπτιδικών υποστρωμάτων, όπου κατά την υδρόλυσή τους λαμβάνει χώρα μεταφορά ενέργειας λόγω συντονισμού κατά Förster (FRET-πεπτίδια). Με χρήση υπολογιστικών τεχνικών προσομοίωσης προσδιορίστηκαν οι αλληλεπιδράσεις κατά την πρόσδεση μιας σειράς πιθανών FRET-πεπτιδικών υποστρωμάτων στην ενεργό περιοχή της MPR και εξετάστηκε η σταθερότητα των σχηματιζόμενων συμπλόκων MPR/FRET-πεπτιδίων. Από αυτά επιλέχθηκαν υποστρώματα που δίεθεταν τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά και ακολούθησε σταδιακή σύνθεση των FRET-πεπτιδικών υποστρωμάτων σε υγρή φάση (Fmoc/Butyl) με την μεθοδολογία των μεικτών ανυδριτών. Από τα φάσματα εκπομπής φθορισμού για την αντίδραση της υδρόλυσης τεσσάρων συντεθέντων FRET-πεπτιδίων από την ΜPR, προέκυψε ότι μόνο τρία από αυτά, τα Abz-GFY-pNA, Abz-SFY-pNA και Abz-GFI-pNA, παρουσίασαν φθορισμό με μέγιστο λem = 415 nm και επομένως συνιστούν υποστρώματα της MPR. Οι κινητικές μελέτες με τα τρία προαναφερθέντα FRET-πεπτιδικά υποστρώματα έδειξαν ότι το Abz-GFY-pNA διαθέτει τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά δηλαδή υψηλή εξειδίκευση κι ευαισθησία. Έτσι, αναπτύχθηκε μια νέα αυτοματοποιημένη και στατιστικά ισχυρή μέθοδος προσδιορισμού δραστικότητας της MPR σε ελεύθερη και ακινητοποιημένη μορφή, βασισμένη στην μεταβολή της έντασης του φθορισμού (λem = 415 nm, λex = 340 nm) κατά την υδρόλυση του υποστρώματος Abz-GFY-pNA, αλλά και πρoτάθηκε ένας νέος μηχανισμός, που διαφωτίζει αρκετά σημεία-κλειδιά της δράσης της MPR και που ενδεχομένως να μπορεί να αντιστοιχηθεί και σε άλλες ασπαρτικοπρωτεϊνάσες.