Διερεύνηση των μοριακών συστατικών που καθορίζουν την εξειδίκευση της GABAA-εργικής αναστολής σε νευρικά κύτταρα, καθώς και των μηχανισμών ενίσχυσής της από ενδογενή νευροστεροειδή

Abstract

In the adult mammalian brain, the maintenance of the dynamic equilibrium between excitation and inhibition is necessary for normal neuronal function. Attenuation of synaptic inhibition can lead to over-excitation, mainly through NMDA-receptor over-activation, with subsequent excessive calcium influx and cell death. On the contrary, enhancement of synaptic inhibition due to GABAₐ-ergic system activation can prevent NMDA-induced cell death. GABAₐ receptor possesses several distinct and diverse binding sites for GABA, barbiturates, benzodiazepines, ethanol and endogenous neurosteroids, such as allopregnanolone (allo), dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfate ester (DHEAS). Neurosteroids are produced in the central nervous system (CNS) de novo from cholesterol, secreted mainly by glia and neurons and accumulated in the brain, independently from the secretion of the peripheral steroidogenic glands. They represent a specific category of neuromodulators, which alter neuronal function probably through their direct, fast, non-genomic interaction with GABAₐ and NMDA receptors. The aim of the present study was to investigate the mechanisms of action of neurosteroids, which are associated with the enhancement of GABAₐ-ergic inhibition and the modulation of intracellular calcium homeostasis, in CNS neurons. We used two pluripotent embryonic cell lines, NT2 (human) and P19 (mouse), which in the presence of retinoic acid can be induced to differentiate into mature, post-mitotic neurons, which express neuronal markers and functional GABAₐ and NMDA receptors. NT2 and P19 precursors were successfully differentiated to NT2-N and P19-N neurons, respectively, expressing two neuron-specific markers, synaptophysin and β-ΙΙΙ tubulin. First, we assessed the effect of Ca²⁺ homeostasis perturbations on neuronal cell viability and apoptosis, as well as, the potent protective role of the neurosteroids allo, DHEA and DHEAS. Since the disturbance of Ca²⁺ homeostasis involves many cellular functions, we used agents that alter intracellular Ca²⁺ concentration through separate pathways: intracellular Ca²⁺ stores depletion focusing in the endoplasmic reticulum, non specific cytoplasmic Ca²⁺ overload, Ca²⁺ sequestration and increased Ca²⁺ influx through membrane receptors (L-glutamic acid and NMDA). Only the depletion of intracellular calcium stores caused excessive apoptotic neuronal death in NT2-N and P19-N neurons. This effect could not be reversed, since neither the presence of allo, DHEA or DHEAS, nor the presence of specific inhibitors of Ca²⁺ overload, such us Ruthenium Red and dantrolene, could abolish neuronal death. Therefore, neurosteroids most likely display specificity in their mechanism of action, which is not connected to massive and general alteration of cytoplasmic Ca²⁺ concentration. We next investigated the effects of elementary Ca²⁺ alterations that are generated from over-activation of NMDA receptor (in the presence of L-glutamate and NMDA). We observed that NT2-N cells were extremely resistant to NMDA- induced excitotoxicity, probably due to the presence of a large number of astrocytes in this particular cell system, which may protect neurons against glutamate toxicity. On the contrary, the presence of glutamate or NMDA resulted in excessive cell death of P19-N neurons. Particularly, NMDA treatment (1 mM, 60 min) resulted in apoptotic cell death, since pronounced DNA laddering and chromatin condensation was observed, phenomena which in the presence of allo or DHEA, were significantly attenuated. Similar experiments in primary cultures of hypothalamic neurons, further confirmed the protective role of neurosteroids on NMDA-induced excitotoxicity. In P19-N neurons NMDA-induced toxicity was probably the result of suppression of the PI3K→Akt pathway, which represents a central regulator of cell survival. Indeed, in the presence of NMDA, the levels of the active phosphorylated Akt kinase were reduced, while allo and DHEA increased significantly the levels of phospho-Akt, in the absence and in the presence of NMDA. The specificity of the neuroprotective effect of the above neurosteroids was confirmed by the use of wortmannin, the PI3K→Akt pathway inhibitor. Additionally, L-Glu or NMDA treatment on P19-N neurons, resulted in significant increase of calcium influx, while pre-treatment with allo or DHEA, inhibited this effect of L-Glu or NMDA. The role of calcium ions on NMDA-induced excitotoxicity was further confirmed by the observation that two calcium chelators, Bapta-AM and EGTA increased the viability of P19-N neurons and restored the levels of phospho-Akt, in the presence of NMDA. Excessive Ca²⁺ influx caused by NMDA, is probably responsible for the activation of the intrinsic mitochondrial apoptotic pathway, since NMDA treatment resulted in translocation of the pro-apoptotic protein Bax from the cytoplasm to the mitochondria, with subsequent release of cytochrome c to the cytoplasm, while no significant changes in the levels of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL, were observed. These results indicate that cytochrome c / Bax mutual translocation is sufficient for triggering apoptosis, in P19-N neurons. Therefore, allo and DHEA inhibited NMDA-induced apoptosis, by directly activating the PI3K→Akt pathway, while preserving cytochrome c in the mitochondria and Bax in the cytoplasm. Similar protective effects were observed by three synthetic neurosteroids, suggesting a potential use of these neurosteroid analogues in excitotoxicity. Finally, we investigated the expression pattern of GABAₐ and NMDA receptor subunit mRNAs, during the differentiation of P19-N neurons and the effects of neurosteroids on GABAₐ receptor plasticity and function. Differentiated P19-N cells were found to express al and β2 subunit mRNAs of GABAₐ receptor and NR1 subunit mRNA of NMDA receptor and short-term treatment with allo or DHEA resulted in α1 and β2 subunit mRNAs upregulation, in a dose- and time- dependent pattern, while the levels of the NR1 subunit mRNA, were not changed significantly. Allo treatment resulted also in significant increase in the protein levels of α1 and β2 subunits of GABAₐR, which probably is accompanied by increased number of functional receptors in the membrane, and increased synaptic inhibition. In summary, our results support the hypothesis that neurosteroids represent a specific class of CNS modulators with potent neuroprotective action, which regulate neuronal function through concurrent influence on neuronal excitability and gene expression.

Στον ώριμο εγκέφαλο των θηλαστικών, η διατήρηση της δυναμικής ισορροπίας μεταξύ διέγερσης και αναστολής είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική νευρωνική λειτουργία. Η μείωση της συναπτικής αναστολής οδηγεί σε υπερδιεγερσιμότητα, κυρίως λόγω αυξημένης ενεργοποίησης των υποδοχέων NMDA και αν παραταθεί, σε υπερβολική είσοδο ασβεστίου (διεγερσιμοτοξικότητα) και κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα, η ενίσχυση της συναπτικής αναστολής, μπορεί να αποτρέψει την εκδήλωση των παραπάνω φαινομένων. Στον υποδοχέα GABAₐ έχουν αναγνωριστεί ξεχωριστές και ευδιάκριτες θέσεις δέσμευσης για το GABA, τα βαρβιτουρικά, τις βενζοδιαζεπίνες, την αιθανόλη και τα ενδογενή νευροστεροειδή, όπως η αλλοπρεγνανολόνη (allo), η δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) και ο θειικός εστέρας της τελευταίας (DHEAS). Τα νευροστεροειδή παράγονται στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) de novo από χοληστερόλη, εκκρίνονται κύρια από νευρογλοιακά αλλά και νευρικά κύτταρα και συγκεντρώνονται στον εγκέφαλο, ανεξάρτητα από την έκκριση των περιφερικών στεροειδογενών αδένων. Αποτελούν μια ειδική κατηγορία ρυθμιστών που επηρεάζουν τη νευρωνική λειτουργία μέσω της άμεσης και ταχείας αλληλεπίδρασής τους με ιονοτροπικούς υποδοχείς, όπως είναι οι υποδοχείς GABAₐ και NMDA. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των κυτταρικών λειτουργιών που επάγονται από τα νευροστεροειδή σε ειδικά κυτταρικά συστήματα έκφρασης υποδοχέων GABAₐ και NMDA. Χρησιμοποιήθηκαν δυο πολυδύναμες εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές, τα ΝΤ2 (ανθρώπου) και Ρ19 (ποντικού) κύτταρα, τα οποία παρουσία ρετινοϊκού οξέος μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ώριμους μετα-μιτωτικούς νευρώνες ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν αντίστοιχα, οι οποίοι εκφράζουν νευρωνικούς δείκτες και λειτουργικούς υποδοχείς GABAₐ και NMDA. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα πρόδρομα κύτταρα ΝΤ2 και Ρ19 διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς σε νευρικά κύτταρα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν αντίστοιχα, καθώς διαπιστώθηκε ότι εκφράζουν τις νευρο-ειδικές πρωτεΐνες συναπτοφυσίνη και β-ΙΙΙ τουμπουλίνη. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της μεταβολής της ομοιόστασης των ιόντων ασβεστίου στη βιωσιμότητα και την απόπτωση των ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν νευρώνων, καθώς και η πιθανή προστατευτική δράση των νευροστεροειδών allo, DHEA και DHEAS. Επειδή η διαταραχή της ομοιόστασης του Ca²⁺ αφορά στο σύνολο των κυτταρικών λειτουργιών, πραγματοποιήθηκαν μεταβολές στην ενδοκυττάρια συγκέντρωση των ιόντων Ca²⁺ από διαφορετικές οδούς: εξάντληση των αποθεμάτων στις ενδοκυττάριες αποθήκες με έμφαση στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ), μη ειδική συσσώρευση Ca²⁺ στα κύτταρα, δέσμευση του Ca²⁺ από ειδικούς παράγοντες και αυξημένη είσοδος Ca²⁺ από μεμβρανικούς διαύλους. Από τα αποτελέσματά μας φάνηκε ότι μόνο οι παράγοντες που επάγουν εκκένωση των ενδοκυττάριων αποθηκών Ca²⁺ του ΕΔ και αύξηση του ενδοκυττάριου pH και/ή απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού, προκάλεσαν εκτεταμένο νευρωνικό αποπτωτικό θάνατο στα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν κύτταρα. Η δράση αυτών των παραγόντων ήταν μη-αντιστρέψιμη, αφού τόσο η παρουσία των τριών νευροστεροειδών, όσο και ειδικών αναστολέων με γνωστή προστατευτική δράση έναντι της Ca²⁺-εξαρτώμενης τοξικότητας, όπως το Ruthenium Red (αναστολέας του μονομεταφορέα Ca²⁺ της μεμβράνης των μιτοχονδρίων) και το dantrolene (αναστολέας των υποδοχέων ρυανοδίνης του ΕΔ), δεν ανέστειλε το νευρωνικό θάνατο. Φαίνεται λοιπόν ότι τα νευροστεροειδή παρουσιάζουν εξειδίκευση στην εκδήλωση νευροπροστατευτικής δράσης, η οποία δε φαίνεται να σχετίζεται με τη συνολική τροποποίηση της συγκέντρωσης του κυτταροπλασματικού Ca²⁺, αλλά πιθανόν με σημειακά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στην πλασματική μεμβράνη. Σε ένα επόμενο στάδιο μελετήθηκαν οι επιπτώσεις των μεταβολών της συγκέντρωσης Ca²⁺ που προκαλούνται από την αυξημένη ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA (παρουσία L-γλουταμινικού οξέος και NMDA), στα ΝΤ2-Ν και Ρ19-Ν κύτταρα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα ΝΤ2-Ν κύτταρα βρέθηκαν ιδιαίτερα ανθεκτικά στην πρόκληση διεγερσιμοτοξικότητας, κάτι το οποίο πιθανόν να οφείλεται στην παρουσία μεγάλου αριθμού αστροκυττάρων στο συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα, που μπορεί να δρουν προστατευτικά. Αντίθετα, στα Ρ19-Ν κύτταρα, η παρουσία γλουταμινικού οξέος ή NMDA ήταν ιδιαίτερα κυτταροτοξική. Ειδικότερα, παρουσία του NMDA (1 mM, 60 λεπτά), παρατηρήθηκε αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος, όπως επιβεβαιώθηκε από τη θραύση του γενετικού υλικού (DNA laddering) και τη συμπύκνωση της χρωματίνης, φαινόμενα τα οποία παρουσία των νευροστεροειδών allo και DHEA (10 μΜ), μειώθηκαν σημαντικά. Ανάλογα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν παράλληλα και σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων υποθαλάμου αρουραίου, έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα. Η NMDA-επαγόμενη τοξικότητα στους Ρ19-Ν νευρώνες, φάνηκε ότι οφείλεται στην αναστολή της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΡΙ3Κ→Akt κινάσης, που αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης. Παρουσία του NMDA παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων της ενεργού φωσφορυλιωμένης Akt κινάσης, ενώ η παρουσία των νευροστεροειδών allo και DHEA, οδήγησε σε σημαντική αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Akt παρουσία του NMDA. Η παρουσία του ειδικού αναστολέα wortmannin, ανέστειλε την ενεργοποίηση της Akt και την ικανότητα των νευροστεροειδών να αποτρέψουν τη μείωση της φωσφορυλίωσης της Akt κινάσης, καθώς και τον κυτταρικό θάνατο που προκαλεί το NMDA, υποδηλώνοντας εξειδίκευση της προστατευτικής δράσης των δύο νευροστεροειδών. Ακόμα, αυτές οι δράσεις των νευροστεροειδών φάνηκε να σχετίζονται άμεσα με την ύπαρξη λειτουργικών υποδοχέων GABAₐ, αφού ανεστάλησαν παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή του υποδοχέα μπικουκουλίνη. Επιπρόσθετα, η επίδραση γλουταμινικού ή NMDA στους Ρ19-Ν νευρώνες, προκάλεσε αύξηση της εισόδου Ca²⁺, η οποία μειώθηκε σημαντικά παρουσία των νευροστεροειδών allo ή DHEA. Ο ρόλος του Ca²⁺ στην NMDA-επαγόμενη διεγερσιμοτοξικότητα, φάνηκε και από το γεγονός ότι η χρήση δυο χηλικών παραγόντων δέσμευσης του Ca²⁺, δηλαδή του Bapta-AM και του EGTA προκάλεσε αύξηση της βιωσιμότητας των Ρ19-Ν κυττάρων και αναστολή της μείωσης των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης Akt. Η αυξημένη εισροή ιόντων Ca²⁺ παρουσία του NMDA, πιθανόν να ευθύνεται και για την ενεργοποίηση του ενδογενούς αποπτωτικού μονοπατιού, αφού σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας το συγκεκριμένο μονοπάτι εμπλέκεται άμεσα στην NMDA-επαγόμενη απόπτωση των Ρ19-Ν κυττάρων. Πράγματι, παρουσία NMDA παρατηρήθηκε μετατόπιση της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bax από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια, με ταυτόχρονη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, χωρίς αντίστοιχες μεταβολές στα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL. Συνεπώς, η αμοιβαία μετατόπιση κυτοχρώματος c / Bax, αποτελεί μια ικανή συνθήκη, για την πυροδότηση της αποπτωτικής διαδικασίας στους Ρ19-Ν νευρώνες Τα νευροστεροειδή allo και DHEA ανέστειλαν την NMDA-επαγόμενη απόπτωση, επάγοντας την ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ→Akt μονοπατιού και διατηρώντας το κυτόχρωμα c στα μιτοχόνδρια και την πρωτεΐνη Bax στο κυτταρόπλασμα. Παρόμοια προστατευτική δράση εκδήλωσαν τρία νέα συνθετικά νευροστεροειδή (ανάλογα της allo και του DHEA), γεγονός που υποστηρίζει μια πιθανή χρησιμοποίησή τους σε καταστάσεις διεγερσιμοτοξικότητας. Τέλος, μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης υπομονάδων των υποδοχέων GABAₐ και NMDA κατά τη διαφοροποίηση των Ρ19 κυττάρων, καθώς και οι πιθανές επιδράσεις των νευροστεροειδών. Παρατηρήσαμε ότι τα διαφοροποιημένα Ρ19-Ν κύτταρα, σε αντίθεση με τα αδιαφοροποίητα, εξέφραζαν τα μετάγραφα των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ, καθώς και της λειτουργικής υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA. Η έκφραση των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ αυξανόταν σημαντικά μετά από μικρής διάρκειας επίδραση (10 μΜ, 24 ώρες) με τα νευροστεροειδή allo ή DHEA και αυτή η επίδραση ακολουθούσε ένα δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο πρότυπο. Αντίθετα, τα επίπεδα των μεταγράφων της υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA, δε μεταβάλλονταν σημαντικά. Παράλληλα, η παρουσία της allo προκάλεσε σημαντική αύξηση και στα επίπεδα των πρωτεϊνών των υπομονάδων α1 και β2 του υποδοχέα GABAₐ, κάτι το οποίο πιθανόν να σημαίνει και αύξηση του αριθμού των λειτουργικών υποδοχέων στην κυτταρική μεμβράνη και επομένως αυξημένη συναπτική αναστολή. Συμπερασματικά, τα νευροστεροειδή φαίνεται ότι αποτελούν μια ειδική κατηγορία ρυθμιστών του ΚΝΣ με πιθανή νευροπροστατευτική δράση, που μπορούν να επηρεάζουν τη νευρωνική λειτουργία, μέσω ταυτόχρονης αλληλεπίδρασης στη νευρική διεγερσιμότητα και τη γονιδιακή έκφραση.