Ο ρόλος της πρωτεΐνης UCH-L1 στη νόσο του Parkinson

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the second most frequent neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease. Its cardinal clinical features include tremor, muscle rigidity, slowness of voluntary movement and postural instability. These symptoms are attributed mainly to a profound reduction of dopamine in the striatum due to a dramatic loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc). Recent evidence suggests a significant genetic contribution to PD. UCH-L1 gene was genetically linked to PD for the first time when a missense mutation, I93M, was identified in a German family with a PD phenotype. However, this mutation was not found in other families with genetically inherited PD. In addition, many, albeit not all, population studies have shown that a UCH-L1 polymorphism, S18Y, is protective against the development of sporadic PD, and this effect is consistently larger in early onset sporadic cases. Overall, the link of the UCH-L1 gene to PD remains controversial. UCH-L1 is an abundant neuronal protein, member of the Ubiquitin C-terminal Hydrolases (UCHs), involved in ubiquitin proteasome system (UPS)-dependent protein degradation. In vitro data indicate that it indeed acts as a UCH, but whether this occurs in vivo is unclear. Other functions of UCH-L1 within the ubiquitin proteasome system (UPS) have also been proposed, such as an E3 ligase action, or a stabilizer of free ubiquitin. Furthermore, in Aplysia, the UCH-L1 homologue may associate with the proteasome and enhance its activity. Therefore, it is widely postulated that UCH-L1 is functionally linked to PD through the UPS. However, the role of UCH-L1 within the UPS and moreover its relationship to other processes related to PD, such as mitochondrial impairment and oxidative stress, remain unknown. The first aim of this study was to investigate the relationship between changes in UCH-L1 gene and Parkinson’s disease in Greek population. To perform this analysis, we generated a database for PD patients in Greece collecting blood and DNA samples from PD patients and healthy controls from “Attikon” Hospital and the General Hospital of Syros. Overall, 170 PD and 130 control cases were studied using the method of PCR and RFLP (restriction fragment length polymorphism) based on the fact that, in the presence of the S18Y polymorphism, the digestion of the PCR product with a specific enzyme results in the generation of two DNA fragments. The samples from PD patients were compared to control samples, focusing on the S18Y polymorphism, which has been found to be protective against the development of sporadic disease in several population studies, as mentioned earlier, and especially in cases with early age of onset. The analysis of the frequencies of genotypes and alleles that carry the S18Y polymorphism among patients and controls showed that the frequencies were the same between categories. This fact implies that the S18Y carriers in the Greek population don’t have a reduced risk of developing PD compared to carriers of the WT allele. However, the comparative analysis only of sporadic cases with early age of onset showed a trend for S18Y carriers to have a delayed age of onset of the disease compared to homozygotes WT/WT, although this difference did not reach statistical significance. Overall, there does not seem to be a negative genetic association of the S18Y polymorphism with PD, at least in this specific Greek sample. There is however potentially a small protective effect of the S18Y polymorphism on age of onset in sporadic cases that deserves further study. Another goal was to study the role of UCH-L1 within the ubiquitin proteasome system (UPS) and its potential participation in mechanisms related to oxidative stress, given their presumed importance in PD pathogenesis. To examine these issues, we investigated the effects of UCH-L1 overexpression under physiological or oxidative stress conditions by using the mitochondrial toxin MPP+ and hydrogen peroxide (H2O2). We discovered that S18Y, but not wild type (WT), UCH-L1 expression in human neuroblastoma cells SH-SY5Y and primary cortical neurons leads to a specific (not observed against other insults, such as proteasomal inhibition or DNA damage) protection from MPP+- and H2O2-induced Reactive Oxygen Species generation and death, linking for the first time this genetic variant with protection from oxidative stress. MPP+ is the active metabolite of MPTP which is a mitochondrial neurotoxin capable of causing Parkinsonism in humans and in animal models. By generating hybrid mutants of S18Y, we showed that this anti-oxidant effect is independent of its known ubiquitin-binding competency or catalytic activity. Importantly, the anti-oxidant effect of S18Y UCH-L1 is potentially quite relevant as a therapeutic target, as it occurs early, at a still unknown point upstream of ROS generation, perhaps linked to the lysosomes, where UCH-L1 has been postulated to act. Moreover, we were able to observe such effects when the levels of the overexpressed protein were similar to the endogenous, despite high transfection efficiency, indicating that these effects occur at physiological levels of expression of this variant in human cells. Regarding the link of UCH-L1 to UPS, we have shown that neither WT nor S18Y UCH-L1 appear to directly impact the proteasome, although they both lead to stabilization of free ubiquitin, as previous studies have reported. In addition, the absence of WT mouse UCH-L1 in neurons derived from gad mice (UCH-L1 KO mice), led to a decrease of free ubiquitin, but no overall decrease in UPS function or enhanced sensitivity to oxidative stress, indicating again that endogenous WT UCH-L1 does not exert an antioxidant function, further reinforcing the unique property of the S18Y variant. Importantly, overexpression of S18Y, but not WT, UCH-L1 in primary cortical neurons by adenoviral infection confirmed the general protective effect of S18Y against MPP+-induced death, previously observed at a single cell level, and showed a clear tendency to preserve axonal morphology. Moreover, WT or S18Y overexpression in differentiated SH-SY5Y cells inducibly expressing α-synuclein (AS) did not affect AS-induced toxicity despite the presumed interaction between UCH-L1 and AS. These results indicate that the protective function of S18Y is selective for oxidative insults. Based on our results achieved in cell culture, we extended this study to the adult nigral dopaminergic system of mice in order to further investigate the physiological function of WT UCH-L1 under oxidative stress conditions in vivo. To study the effect of UCH-L1 gene to neurodegeneration caused by MPTP toxin in vivo, we exposed both gad mice and their corresponding WT littermates to MPTP and assessed the potential differential effects on striatal dopamine and TH content and substantia nigra neuron number. Gad mice did not show dysfunction of the dopaminergic system and moreover were not more vulnerable regarding their response to MPTP. These results confirmed the first indications from the in vitro experiments that the WT UCH-L1 protein does not possess, even to a lesser extent, an anti-oxidant capacity similar to S18Y UCH-L1 in vivo. The data from this study suggest that the S18Y UCH-L1 variant confers a novel anti-oxidant function not present in the WT form, which may underlie the protective effects of this variant in certain PD populations. Our results provide also indirect evidence for the importance of oxidative stress as a pathogenetic factor in sporadic PD and may reveal new mechanisms through which UCH-L1 might be linked to PD pathogenesis. Such results may open the avenue for the discovery of potential novel therapeutic responses in PD that are based on innate mechanisms of defense against neurotoxicity related to oxidative stress.

Η νόσος του Parkinson αποτελεί μία από τις πιο συχνές νευροεκφυλιστικές διαταραχές μετά την άνοια του Alzheimer. Τα βασικά κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου είναι ο τρόμος, η βραδυκινησία, η αστάθεια στάσης και βάδισης και η μυϊκή δυσκαμψία που αποτελούν τα τέσσερα κύρια κινητικά συμπτώματα που χαρακτηρίζουν τη νόσο. Αυτά τα συμπτώματα οφείλονται κατά κύριο λόγο στη σημαντική μείωση των επιπέδων της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα εξαιτίας της δραματικής απώλειας των ντοπαμινεργικών νευρώνων στη συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας του εγκεφάλου. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν μία σημαντική συμβολή γενετικών παραγόντων στην παθογένεια της νόσου του Parkinson. Το γονίδιο της UCH-L1 συσχετίστηκε με τη νόσο του Parkinson για πρώτη φορά όταν μία σημειακή μεταλλαγή, I93M, ταυτοποιήθηκε σε μία γερμανική οικογένεια με παρκινσονικό φαινότυπο, αλλά η παθογένεια αυτής της μεταλλαγμένης μορφής παραμένει αμφιλεγόμενη καθώς δεν έχει βρεθεί σε άλλες οικογένειες με γενετικά κληρονομήσιμη νόσο του Parkinson. Επιπρόσθετα, πολλές, αν και όχι όλες, πληθυσμιακές μελέτες έχουν δείξει ότι ένας πολυμορφισμός στο γονίδιο της UCH-L1, S18Y, είναι προστατευτικός έναντι της εκδήλωσης της σποραδικής νόσου του Parkinson, και αυτή η επίδραση έχει βρεθεί σταθερά μεγαλύτερη στα σποραδικά περιστατικά με πρώιμη ηλικία έναρξης συμπτωμάτων. Συνολικά, η συσχέτιση του γονιδίου της UCH-L1 με τη νόσο του Parkinson παραμένει υπό αμφισβήτηση. H UCH-L1 είναι μία νευρωνική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα, μέλος της οικογένειας των υδρολασών ουμπικουΐτίνης του καρβοξυ-τελικού άκρου (UCHs), η οποία συμμετέχει στην αποικοδόμηση των πρωτεϊνών από το σύστημα ουμπικουιτίνης-πρωτεασώματος. Αν και υπάρχουν πειραματικά δεδομένα (in vitro) που υποστηρίζουν τη δράση της UCH-L1 ως υδρολάσης ουμπικουιτίνης, δεν είναι σαφές ότι αυτό συμβαίνει επίσης σε επίπεδο οργανισμού (in vivo). Στα πλαίσια του συστήματος ουμπικουιτίνης πρωτεασώματος, έχουν προταθεί και άλλες λειτουργίες για την πρωτεΐνη UCH-L1, όπως αυτή της Ε3 λιγάσης ή της σταθεροποίησης της ελεύθερης ουμπικουιτίνης. Επιπλέον, στον οργανισμό Aplysia η ομόλογη πρωτεΐνη της UCH-L1 σχετίζεται με το πρωτεάσωμα και ευοδώνει τη λειτουργία του. Εξαιτίας αυτών των ενδείξεων έχει προταθεί ότι η UCH-L1 πιθανότατα συνδέεται λειτουργικά με τη νόσο μέσω του μονοπατιού ουμπικουιτίνης πρωτεασώματος. Παρ’όλ’αυτά, ο ρόλος της UCH-L1 στα πλαίσια του συστήματος ουμπικουΐτίνης-πρωτεασώματος δεν έχει διερευνηθεί λεπτομερώς, ενώ η συμμετοχή της σε άλλες διαδικασίες που ίσως σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της νόσου, όπως η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και το οξειδωτικό στρες, παραμένει επίσης άγνωστη. Ένας από τους σκοπούς της παρούσας εργασίας ήταν να εξετασθεί το κατά πόσον υπάρχει συσχέτιση αλλαγών στο γονίδιο που κωδικοποιεί την UCH-L1 με τη νόσο του Parkinson στον ελληνικό πληθυσμό. Για να πραγματοποιηθεί μία τέτοια μελέτη κατασκευάσαμε μία βάση δεδομένων για ασθενείς με νόσο του Parkinson στην Ελλάδα συλλέγοντας δείγματα αίματος και DNA από ασθενείς και από πληθυσμό ελέγχου από το νοσοκομείο «Αττικόν» και το Γενικό Νοσοκομείο της Σύρου. Συνολικά, μελετήθηκαν 170 περιστατικά ασθενών με νόσο του Parkinson και 130 δείγματα από μάρτυρες με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR και RFLP (πέψη με περιοριστικά ένζυμα και ανάλυση των τμημάτων DNA) με βάση το γεγονός ότι, παρουσία του πολυμορφισμού S18Y, η πέψη του προϊόντος της PCR με ένα συγκεκριμένο ένζυμο οδηγεί στη δημιουργία δύο μικρότερων τμημάτων DNA. Τα δείγματα από ασθενείς με νόσο του Parkinson συγκρίθηκαν με δείγματα από τον πληθυσμό ελέγχου, εστιάζοντας ιδιαίτερα στον πολυμορφισμό S18Y, ο οποίος, όπως προαναφέρθηκε, έχει βρεθεί ότι προστατεύει έναντι της εκδήλωσης της σποραδικής νόσου του Parkinson σε πολλές πληθυσμιακές μελέτες, και ιδιαίτερα στα περιστατικά με πρώιμη ηλικία έναρξης συμπτωμάτων. Η ανάλυση των συχνοτήτων των γονοτύπων και των αλληλίων που φέρουν τον πολυμορφισμό S18Y μεταξύ ασθενών και μαρτύρων έδειξε ότι οι συχνότητες δεν παρουσίασαν διαφορές μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών, γεγονός που φανερώνει ότι οι φορείς του πολυμορφισμού S18Y στον ελληνικό πληθυσμό δεν παρουσιάζουν διαφορετικές πιθανότητες κινδύνου εμφάνισης της νόσου σε σχέση με τα άτομα που δε φέρουν τον πολυμορφισμό. Ωστόσο, η συγκριτική ανάλυση μόνο των σποραδικών περιστατικών με πρώιμη ηλικία έναρξης συμπτωμάτων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων έδειξε μία τάση των φορέων του πολυμορφισμού S18Y να έχουν καθυστερημένη ηλικία έναρξης της νόσου σε σχέση με τους ομοζυγώτες WT/WT, αν και η διαφορά αυτή δεν έφτασε σε στατιστικώς σημαντικά επίπεδα. Συμπερασματικά, δε φαίνεται να υπάρχει αρνητική γενετική συσχέτιση του πολυμορφισμού S18Y με την ανάπτυξη της νόσου του Parkinson στο συγκεκριμένο ελληνικό πληθυσμό, αν και βρέθηκε μία πιθανή μικρή προστατευτική επίδραση του S18Y ως καθυστέρηση της ηλικίας έναρξης των συμπτωμάτων για τις σποραδικές μορφές. Ένας άλλος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της UCH-L1 σε σχέση με το σύστημα ουμπικουιτίνης πρωτεασώματος καθώς και η πιθανή συμμετοχή της σε μηχανισμούς που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. Για να διερευνήσουμε αυτά τα ζητήματα, εξετάσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης της UCH-L1 κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή συνθήκες οξειδωτικού στρες χρησιμοποιώντας τη μιτοχονδριακή τοξίνη MPP+ και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2). Το MPP+ είναι ο ενεργός μεταβολίτης του MPTP που είναι μία μιτοχονδριακή νευροτοξίνη ικανή να προκαλεί παρκινσονισμό σε ανθρώπους και σε ζωικά μοντέλα. Η έκφραση της S18Y, αλλά όχι της φυσικού τύπου (WT), UCH-L1 σε ανθρώπινα κύτταρα από νευροβλάστωμα SH-SY5Y και σε πρωτογενείς φλοιικούς νευρώνες βρέθηκε ότι προσφέρει μία ειδική (που δεν παρατηρείται έναντι άλλων παραγόντων, όπως η αναστολή του πρωτεασώματος ή η βλάβη στο DNA) προστατευτική δράση έναντι της γένεσης αντιδραστικών ενώσεων οξυγόνου (Reactive Oxygen Species,ROS) και του θανάτου που προκαλείται από το MPP+ και το υπεροξείδιο του υδρογόνου H2O2. Αυτό το εύρημα αποτελεί την πρώτη ένδειξη ότι αυτή η γενετική παραλλαγή της πρωτεΐνης UCH-L1 μπορεί να σχετίζεται με προστασία από το οξειδωτικό στρες. Κατασκευάζοντας μεταλλαγμένα υβριδικά πλασμίδια της S18Y UCH-L1, δείξαμε ότι αυτή η αντιοξειδωτική δράση είναι ανεξάρτητη των δύο χαρακτηρισμένων ιδιοτήτων της UCH-L1, της πρόσδεσης ή της υδρόλυσης της ουμπικουιτίνης. Είναι σημαντικό ότι η αντιοξειδωτική δράση της S18Y UCH-L1 μπορεί να αποτελέσει ένα θεραπευτικό στόχο καθώς συμβαίνει σε ένα πρώιμο, προς το παρόν άγνωστο, στάδιο πριν τη γένεση των ROS, ίσως στο επίπεδο των λυσοσωμάτων, όπου η UCH-L1 θεωρείται ότι μπορεί να δρα. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν τα επίπεδα της υπερεκφρασμένης πρωτεΐνης ήταν παρόμοια με τα ενδογενή επίπεδα, παρά την υψηλή αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης των κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα φαινόμενα συμβαίνουν σε φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης της S18Y UCH-L1 σε ανθρώπινα κύτταρα. Όσον αφορά στη συσχέτιση της UCH-L1 με το σύστημα ουμπικουιτίνης-πρωτεασώματος, φαίνεται ότι ούτε η WT ούτε η S18Y έχουν κάποια άμεση επίδραση στο πρωτεάσωμα, παρά το γεγονός ότι και οι δύο οδηγούν στη σταθεροποίηση των επιπέδων της ελεύθερης ουμπικουιτίνης, όπως έχουν δείξει προηγούμενες μελέτες. Επιπρόσθετα, έλλειψη της WT UCH-L1 του ποντικού σε νευρώνες απομονωμένους από μύες gad, μύες που δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη UCH-L1 (UCH-L1 KO), είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της ελεύθερης ουμπικουιτίνης, αλλά όχι συνολική ελάττωση της λειτουργίας του συστήματος ουμπικουιτίνης-πρωτεασώματος ή αυξημένη ευαισθησία στο οξειδωτικό στρες. Αυτό υποδηλώνει ότι η ενδογενής WT UCH-L1 δεν παρουσιάζει μία ανάλογη αντιοξειδωτική λειτουργία, γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι η αντικατάσταση στη θέση 18 προσδίδει μία νέα μοναδική ιδιότητα στην S18Y UCH-L1. Προς επίρρωση αυτού του ευρήματος, η υπερέκφραση της S18Y, αλλά όχι της WT, UCH-L1 σε καλλιέργειες πρωτογενών φλοιικών νευρώνων με διαμόλυνση μέσω αδενοϊών επιβεβαίωσε την προστατευτική δράση της S18Y UCH-L1 έναντι του θανάτου που προκαλείται από το MPP+, η οποία είχε προηγουμένως παρατηρηθεί σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, ενώ παράλληλα οδήγησε σε μία καθαρή τάση διατήρησης της μορφολογίας των αξόνων. Επιπλέον, η υπερέκφραση της WT ή της S18Y UCH-L1 σε διαφοροποιημένα κύτταρα SH-SY5Y που εκφράζουν την α-συνουκλεΐνη (AS) με επαγόμενο τρόπο δεν είχε κάποια επίδραση στην τοξικότητα που επάγεται από την α-συνουκλεΐνη παρά την αλληλεπίδραση που έχει προταθεί μεταξύ της UCH-L1 και της AS. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι η προστατευτική λειτουργία της S18Y UCH-L1 είναι επιλεκτική έναντι των οξειδωτικών παραγόντων. Με βάση τα αποτελέσματα που προέκυψαν στα συστήματα κυτταροκαλλιεργειών, προεκτείναμε τη μελέτη στο ενήλικο ντοπαμινεργικό σύστημα της μέλαινας ουσίας μυών με σκοπό να διερευνήσουμε περαιτέρω τη φυσιολογική λειτουργία της WT UCH-L1 κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες in vivo. Για να μελετήσουμε την επίδραση του γονιδίου της UCH-L1 στη νευροεκφύλιση που προκαλείται από τη μιτοχονδριακή τοξίνη MPTP in vivo, εκθέσαμε φυσιολογικούς και gad μύες στο MPTP και ερευνήσαμε την πιθανή διαφορική αντίδραση αυτών των δύο κατηγοριών μυών ως προς τη διατήρηση της πυκνότητας των νευρικών απολήξεων και των επιπέδων ντοπαμίνης στο ραβδωτό και την επιβίωση των νευρώνων στη μέλαινα ουσία μετά την έκθεση στο MPTP. Οι μύες gad δεν παρουσίασαν δυσλειτουργία του ντοπαμινεργικού συστήματος και επιπλέον δεν ήταν περισσότερο ευαίσθητοι ως προς την απόκρισή τους σε οξειδωτικούς παράγοντες όπως το MPTP. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τις πρώτες ενδείξεις από τα in vitro πειράματα ότι η UCH-L1 φυσικού τύπου δε διαθέτει, ούτε σε μικρότερο βαθμό, αντίστοιχες αντιοξειδωτικές ιδιότητες με την S18Y UCH-L1 in vivo. Τα δεδομένα της παρούσας εργασίας υποστηρίζουν ότι η S18Y UCH-L1 προσδίδει μία νέα αντιοξειδωτική λειτουργία που δεν ενυπάρχει στην πρωτεΐνη φυσικού τύπου, η οποία μπορεί να ευθύνεται για την προστατευτική επίδραση αυτού του πολυμορφισμού σε διάφορους πληθυσμούς με νόσο του Parkinson. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν επίσης έμμεσες ενδείξεις για τη σημασία του οξειδωτικού στρες ως παράγοντα παθογένειας στη σποραδική νόσο του Parkinson και μπορεί να αποκαλύψουν νέους μηχανισμούς μέσω των οποίων η πρωτεΐνη UCH-L1 μπορεί να σχετίζεται με την παθογένεια της νόσου. Τέτοια δεδομένα μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την εύρεση νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη νόσο του Parkinson που βασίζονται σε εσωτερικούς μηχανισμούς άμυνας έναντι της νευροτοξικότητας που σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες.